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狗外周血单核细胞分离液试剂盒

本品用于分离狗外周血单核细胞。

本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

狗外周血单核细胞分离液试剂盒

操作步骤： 1. 取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝血均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2. 取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如稀释后的血液样本小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如稀释后的血液样本大于5ml，试剂总量与稀释后的血液样本量相等），两种试剂的分层一定要清晰。 3. 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象） 4. 室温，水平转子500~800g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，分离条件需自行摸索，离心转速不超过1000g）。 5. 离心后将出现明显的分层： 层为血浆层；第二层为白色单核细胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。 6. 小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。 7. 弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。 8. 重复步骤7 9. 弃上清，细胞重悬备用。 10. 差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以10 6个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。 1) 2~4 h内贴壁的为单核细胞。 2) 10~24 h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞 。 3) 不贴壁的为淋巴细胞。根据不同细胞的贴壁时间存在差异，以达到简单纯化单核细胞的目的。此法成本低，操作简便。如需获得高纯度的目的细胞则需选用免疫磁珠分选或者是应用流式技术分选细胞。