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磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒

操作步骤：

一、样本的前处理

1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10 4个）提取液体积（mL）为 500-1000： 1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或者 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、 血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤：

1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长 340nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定（1） 在试剂二瓶中加入 17ml 试剂一和 1.13ml 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 5 分钟。用不完的试剂 4℃保存一周。（2） 在试剂三中加入 1ml 蒸馏水充分混匀，冰上放置备用；用不完的试剂 4℃保存一周。（3） 在试剂四中加入 1ml 蒸馏水充分混匀，冰上放置待用；用不完的试剂 4℃保存一周。（4） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、10μl 试剂三、10μl 试剂四和 170μl 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 10min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒

PFK 活力单位的计算：用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、 血清（浆）PFK 活力的计算: 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/mL）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷V 样÷T=321×△A

2、 组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算: （1） 按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/mg prot）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 样)÷T=321×△A ÷Cpr （2） 按样本鲜重计算单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/g 鲜重）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321×△A ÷W （3） 按细菌或细胞密度计算单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.642×△A V 反总：反应体系总体积，2×10 -4L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下：

1 血清（浆）PFK 活力的计算: 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 -1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/mL）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷V 样÷T=642×△A 2 组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算: （4） 按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/mg prot）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 样)÷T=642×△A ÷Cpr （5） 按样本鲜重计算单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/g 鲜重）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=642×△A ÷W （6） 按细菌或细胞密度计算单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。 PFK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.284×△A V 反总：反应体系总体积，2×10 -4L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。试剂三：粉剂×1 支，4℃保存。试剂四：液体×1 支，4℃保存