科佰生物作為一家提供企業(yè)核酸診斷標準品的企業(yè)，在該領域已經(jīng)深耕多年，與全國該領域90%的企業(yè)都有過合作，成功支持過很多企業(yè)的試劑盒研發(fā)和獲批，在該領域有豐富的經(jīng)驗。根據(jù)我們對市場的調研，對客戶需求的理解，我們把我們的產品線劃分為多個模塊，主要為支持PCR的單點mutation、fusion和CNV產品，支持NGS的小panel和大panel(泛腫瘤、包含TMB和MSI)產品，支持IHC和Fish的FFPE block產品，支持標準品定標的dPCR檢測試劑盒產品等。

接下來的幾期，我們陸續(xù)會針對不用的腫瘤，遵循NCCN指南的標注，為大家分享我們對企業(yè)參考品選擇的看法。

肺癌（Lung cancer）是惡性的肺部腫瘤，肇因于肺部組織細胞不受控制地生長。如不治療，腫瘤細胞會轉移至鄰近組織或身體的其他地方。肺部常見的原發(fā)性惡性腫瘤屬于上皮癌，可粗分為小細胞癌（SCLC）和非小細胞癌（NSCLC）。根據(jù)《2018年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》顯示：

1. 2018年將有大約1810萬癌癥新發(fā)病例和960萬癌癥死亡病例。

2. 肺癌依舊是發(fā)病率（11.6%）和死亡率（18.4%）較高的惡性腫瘤。發(fā)病率其次為女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、結直腸癌（6.1%）；死亡比例其次為結直腸癌（9.2%）、胃癌（8.2%）、肝癌（8.2%）。 

從中國來看，肺癌是發(fā)病率（女性為乳腺癌較高）和死亡率較高的癌癌種。

肺癌的治療一般分為外科治療、放療、化療和免疫治療，針對化療和免疫治療，臨床已經(jīng)有很多靶向藥物，包含小分子和大分子藥物，出于精準診療的原則，治療前分子與生物標志物的分析尤為重要，針對肺癌的分子標志物主要包含EGFR，ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個可能有助于選擇適于免疫治療患者的新型生物標志物，目前尚無測量TMB的共識)，各個分子標志物的臨床意義和指導，請點擊下載NCCN指南。因此圍繞這些基因的診斷對肺癌的治療有著非常重要的作用，被廣泛應用于臨床。

自然而然，國內外針對肺癌開發(fā)的診斷試劑盒是熱門的，也是比較成熟的，甚至可以說作為腫瘤領域診斷公司的一張入場券，不管是已經(jīng)獲批的，還是正在申報的，甚至剛開始研發(fā)的，大家都在這個領域摩拳擦掌，準備大干一番。

圍繞肺癌診療相關的EGFR,ALK，ROS1,BRAF,KRAS,MET,RET,ERBB2,PD1/PDL1,TMB(TMB是一個可能有助于選擇適于免疫治療患者的新型生物標志物，目前尚無測量TMB的共識)，我們依次分析各個基因在診療中的選擇。

分子標志物：EGFR

?表皮生長因子受體(EGFR)基因突變: EGFR 是一種常見于上皮細胞表面的受體酪氨酸激酶，在多種人類惡性腫瘤中往往呈過表達。

EGFR中常見的突變(外顯子19缺失,外顯子21中p.L858R點突變)與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療的應答情況相關;近期的資料表明未攜帶EGFR敏感突變的腫瘤不應在任何時段的治療中接受EGFR TKI的治療。

²一些少見的EGFR突變,這類突變累計占到EGFR突變非小細胞肺癌的近10% (例如，外顯子19插入，p.L861Q、 p.G719X、p.S768I) 也與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應答情況相關，但所研究的患者數(shù)目較少。

²一些EGFR突變與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應答情況缺乏相關性，包括大多數(shù)EGFR外顯子20插入，以及p.T790M。

-大多數(shù)EGFR外顯子20插入突變預示著對臨床可達到的酪氨酸激酶抑制劑治療(TKI) 水平的抵抗(耐藥)。

-例外情況是一種罕見的EGFR外顯子20插入變異型，p.A763_ Y764insFQEA,其與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI) 治療的應答情況相關。因此,對EGFR外顯子20插入的認識必須建立在特定基因序列變異的基礎上。

-與EGFR TKI初始治療后疾病復發(fā)常見的相關發(fā)現(xiàn)是p.T790M突變,這是已知的耐藥機制。如果在TKI暴露前發(fā)現(xiàn)該突變,則應考慮行遺傳咨詢，因為種系p.T790M突變與家族性肺癌易感性有關，故需要額外的檢測。

²隨著高通量測序(NGS)檢測使用的增加，其它EGFR變異型的檢出率也在增高;但是，個體變異的臨床意義不易明確。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況、 種族和組織學特征——均與某種EGFR突變的存在情況相關;不過，這些特征不應用于選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:實時聚合酶鏈反應(PCR)、 桑格(Sanger)測序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通量測序法(NGS) 是檢測EGFR突變狀態(tài)的常用的方法。

分子標志物：ALK

?簡變性淋巴瘤激酶(ALK) 基因重排: ALK 是非小細胞肺癌中一種可被重排的受體酪氨酸激酶，重排導致通過ALK激酶結構域的信號轉導失調和異常。

²ALK常見的融合對象是棘皮動物微管相關樣蛋白4 (EML4),但其它多種融合對象也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。

²ALK重排的存在與對ALK酪氨酸激酶抑制劑治療(TKI)的應答情況相關,近期研究顯示在一線治療中阿來替尼(Alectinib) 比克唑替尼(Crizotinib) 的療效更佳。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況和組織學特征已被證實與某種ALK重排的存在情況相關;不過，這些特征不應用于選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法是一個廣泛使用的方法。免疫組化法可作為一種有效的篩查手段使用。經(jīng)FDA批準的免疫組化法(ALK[D5F3]CDx檢測)可單獨使用，無需經(jīng)FISH確認結果，但鼓勵對結果行二次確認。多種高通量測序(NGS)法可檢測ALK融合突變,而有時會用到靶向實時多聚酶鏈反應(PCR)檢測,不過它們均不太可能檢出帶有新的融合對象的突變。

分子標志物：ROS1

?ROS1 (ROS原癌基因1)基因重排: ROS1是非小細胞肺癌中一種可被重排的受體酪氨酸激酶,重排導致通過ROS1激酶結構域的信號轉導失調和異常。

²發(fā)現(xiàn)的ROS1融合對象有多種，常見的融合對象包括: CD74、 SLC34A2、 CCDC6 和FIG。

²ROS1重排的存在與口服ROS1酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療效相關。

²某些臨床病理特征——諸如吸煙情況和組織學特征——已被證實與某種ROS1 重排的存在情況相關:不過，這些特征不應用于選擇接受檢測的患者。

²檢測方法:熒光原位雜交(FISH)分離探針法可以使用:不過,其可能無法檢測FIG-ROS1變異型。免疫組化法(IHC)可以使用;不過,針對ROS1融合突變的IHC檢測敏感性低，而隨訪驗證性檢驗是作為一種篩查手段使用的ROS1 IHC法*的一部分。多種高通量測序(NGS)法可檢測ROS1融合突變,而有時會用到靶向實時多聚酶鏈反應(PCR) 檢測，不過它們均不太可能檢出帶有新的融合對象的突變(這樣會導致無法檢出ROS1融合事件)。

分子標志物：BRAF

?BRAF (B-Raf原癌基因)點突變：BRAF是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,屬于經(jīng)典的MAP/ERK信號通路的一部分。BRAF突變激活導致通過MAP/ERK路徑信號轉導失調。

²BRAF突變可見于非小細胞肺癌。導致氨基酸位點600發(fā)生變化(p.V600E)的某種特定突變的存在已被證實與口服型BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合治療的效果(應答情況)相關。

²注意其它BRAF突變已在非小細胞肺癌中被觀察到，而目前這些突變對于治療選擇的影響尚未明確。

²檢測方法:實時聚合酶鏈反應(PCR)、桑格(Sanger) 測序法(配合腫瘤富集操作)，以及高通測序法(NGS)是檢測BRAF突變狀態(tài)的常用的方法。盡管一種抗-BRAF p.V600E-特異性單克隆抗體已投入商用，而且一些研究已經(jīng)測評了該方法的應用情況，但只有在大規(guī)模驗證后才應該使用該方法。

分子標志物：KRAS

?KRAS (KRAS原癌基因)點突變: KRAS是一種具有內在GTP酶活性的G蛋白，而激活突變導致通過MAP/ERK路徑信號轉導失調。

²KRAS突變常見于密碼子12,但其它突變類型也可在非小細胞肺癌中見到。

²當與無KRAS突變的腫瘤患者相比，KRAS突變的存在預示生存不良。

²KRAS 突變已被證實與EGFR TKI治療的效果(應答情況)降低相關。

²由于變異靶點的重疊可能性小，故KRAS突變的存在可能表明患者將不會從進一步的分子檢測中獲益。

分子標志物：其他

·靶向治療中疾病進展時的檢測:

?受惠于上文列舉的多個檢測項，對治療耐藥的分子機制的認識也隨之增加。當靶向治療中疾病活動性進展時，對標本重新檢測可為下一步治療提供線索:

²對于已經(jīng)EGFR TKI治療，攜帶有潛在的EGFR敏感突變的患者，適宜的檢測項目起碼包括p.790M的高敏評估:當沒有p.T790M存在證據(jù)時，針對替代性耐藥機制(MET擴增、ERBB2擴增)的檢測可被用來指導患者的其它治療。p.T790M 的存在可指示患者接受第三代EGFR TKI治療。

-檢測EGFR p.T790M的試驗設計的分析敏度應至少達到5%等位基因分數(shù)。早期的敏感突變可被用作許多試驗中的一種內部對照以確定如果作為亞克隆事件存在的話，p.T790M 是否處于檢測范圍內。

²對于已經(jīng)ALK TKI治療的攜帶有潛在ALK重排突變的患者,還不清楚發(fā)現(xiàn)特定的酪氨酸激酶結構域突變是否能確定合理的下一步治療,但一些初步數(shù)據(jù)提示特定的酪氨酸激酶結構域突變能影響后續(xù)治療。

其中涉及的基因有MET skiping、MET擴增、RET重排和ERBB2擴增。

分子標志物：panel

對于PCR的企業(yè)參考品，如上的位點基本全部滿足了，那針對NGS的panel型參考品，我們需要把重要的位點一起檢測，這就要要求混樣，混樣有一定的原則，根據(jù)混樣的原則和市場需求，我們開發(fā)了一些參考盤，具體如下：

綜上，按照NCCN的指南，按照臨床的藥物，按照伴隨診斷的需求，科佰生物開發(fā)了針對肺癌PCR的單點參考品、標準品，針對肺癌NGS的panel型的參考品、標準品，滿足不同客戶的需求。

標準品選擇好了，接下來就是做性能評價，讓我們先學習下指導原則，對于性能評價的規(guī)定。詳見《從《指導原則》中分析參考品盤設計》。