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DNA修饰酶
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  • DNA修饰酶

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货物所在地: 上海上海市
更新时间: 2025-03-03 15:02:21
期: 2025年3月3日--2025年9月3日
已获点击: 328
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产品简介

DNA修饰酶通过对蛋白酶主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造,改造的目的在于改变酶的一些性质,创造出天然酶不具备的某些优良性状,扩大酶的应用已达到较高的经济效益。

详细介绍

操作步骤

1.培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB 琼脂培养基上,37℃培养24~48h。
2.从细菌中快速提取制备质粒DNA。

3.质粒DNA 的酶解
将自提质粒加入20μL 的 TE 缓冲液,使 DNA *溶解。取清洁、干燥、灭菌的离心管编号用微量加样器按各种试剂分别加入每个离心管内。
4.DNA酶切加样要求:

   1).选择合适的酶切位点,并找到*缓冲液的酶切Buffer,可保证几乎*的酶活性.

   2).每小时10-15U/ul的酶可以酶切1ug的质粒DNA,按照比例计算酶的使用量,酶量的加倍,可适当减少酶切时间。

   3).质粒DNA的量通常在反应体系中扩大10倍量,确保酶切*。1小时内,50μl反应体积中,降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶:DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下,要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。 

   4).有的酶要求100μg/ml的BSA以实现*活性。在这种情况下,我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 

   5).补无菌双蒸水至相应体系,依实际情况做相应调整,加样后,小心混匀,置于37℃水浴中,酶解2~3h,反应终止后,各酶切样品于冰箱中贮存备用。
5.DNA 琼脂糖凝胶电泳
  (1)琼脂糖凝胶的制备:称取0.6g 琼脂糖,置于三角瓶中,加入50 mL TBE 缓冲液,经微波炉加热全部融化后,取出摇匀,此为1.2%的琼脂糖凝胶。
  (2)胶板的制备:将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小心倒入凝胶液,使胶液缓慢展开,直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层,室温下静置30 min,待凝固*后,轻轻拔出样品槽模板,在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
  (3)加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品,要用蒸馏水反复洗净微量加样器,以防止相互污染。
6. 电泳
加完样品后的凝胶板,立即通电。样品进胶前,应使电流控制在20mA,样品进胶后电压控制在60~80V,电流为40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板1~2cm 处,停止电泳。
7、结果与观察
在波长为254nm 的紫外灯下,观察DNA 存在处显示出的荧光条带。

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