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siRNA干擾載體構(gòu)建與引物設(shè)計(jì)

 

siRNA干擾載體構(gòu)建過(guò)程中，針對(duì)siRNA設(shè)計(jì)的引物是怎么設(shè)計(jì)的?

一般是合成一對(duì)引物，然后退火，再與線性化的載體做連接。由于引物比較長(zhǎng)，所以合成時(shí)一般都會(huì)有比較多的堿基突變，因此，做shRNA表達(dá)載體構(gòu)建的主要難度，在于篩選出正確的克隆，有時(shí)候可能要選很多個(gè)克隆測(cè)序才能篩到想要的。具體的序列組成，一般是sense-loop-antisense。不同的公司會(huì)有不同的設(shè)計(jì)原則的。

經(jīng)驗(yàn)：我們一般不去考慮構(gòu)建載體來(lái)得到siRNA！
載體表達(dá)siRNA方法主要存在以下缺點(diǎn)：
1、外源導(dǎo)入shRNA的表達(dá)會(huì)干擾細(xì)胞本身miRNA的正常表達(dá)，而miRNA在基因的表達(dá)調(diào)控方面有著至關(guān)重要的作用，目前已經(jīng)證實(shí)很多疾病的產(chǎn)生通miRNA的表達(dá)異常存在確切關(guān)系，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道和證實(shí)；
2、載體構(gòu)建的周期長(zhǎng)，操作較為復(fù)雜，試驗(yàn)重復(fù)性不好，做過(guò)的人應(yīng)該大多都知道；
3、載體用于體內(nèi)試驗(yàn)的毒性非常大，容易激發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，副作用大，已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)；
4、通量低，影響因素更多，體內(nèi)試驗(yàn)的效果很差，存在安全性的問(wèn)題；
5、shRNA的表達(dá)在時(shí)間和表達(dá)量上都較難控制等。
這也是為什么現(xiàn)在10多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)的RNAi藥物幾乎都是用化學(xué)合成的siRNA來(lái)做的原因！