會(huì)員.png)
13
當(dāng)前位置：上海添時(shí)科學(xué)儀器有限公司>>技術(shù)文章>>上海添時(shí)T960 PCR儀的改進(jìn)與完善史
上海添時(shí)T960 PCR儀的改進(jìn)與完善史
T960 PCR儀就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將T960 PCR儀分為普通T960 PCR儀，梯度T960 PCR儀，原位T960 PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量T960 PCR儀四類。
T960 PCR儀的改進(jìn)與完善
Mullis初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段，其缺點(diǎn)是：
?、貹lenow酶不耐高溫， 90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。
?、谝镦溠由旆磻?yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其T960 PCR儀產(chǎn)物特異性較差，合成的
DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的T960 PCR儀技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，
但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成
一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給T960 PCR儀技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得T960 PCR儀技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行T960 PCR儀，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度2.0Kb。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為T(mén)aqDNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使T960 PCR儀廣泛的被應(yīng)用。