易洗脱链霉亲和素-琼脂糖

1 、产品介绍

ee-SANUPharoseFF是将基因工程改造的链霉亲和素（Streptavidin ，SA）和琼脂糖凝胶偶联而成的亲和层析分离介质。ee意为易洗脱（easy elution），即可以温和洗脱结合在介质上的生-物素化物质，如生-物素化抗原、生-物素化抗体、生-物素化蛋白、生-物素化核酸等，可用于Avi-Tag融合表达的生-物素化蛋白的纯化、经过标记反应后的生-物素化和非生-物素化物质的分离、生-物素化抗原抗体固定化和重复回收利用等。

Streptavidin NUPharoseFF，由于链霉亲和素与生-物素的超-强亲和力，温和常用的方法不能将生-物素标记物质洗脱。ee-SA配基经过分子层面的设计改造，大幅降低了与生-物素的亲和力，同时保持了与生-物素的特异性。结合在ee-SANUPharose FF填料上的生-物素化物质可通过含D-生-物素的缓冲液竞争洗脱，该洗脱方式温和，一般不会影响目标物的活性，洗脱液中的D-生-物素可通过换液方式去除。因而通过ee-SANUPharoseFF的一步层析就可获得有活性、高纯度的生-物素化物质。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：D-生-物素标记 BSA ，10%流穿，6 min 停留时间；c 10 cm 柱高下的最大测试流速。

3 、易洗脱链霉亲和素填料应用原理简介

链霉亲和素与D-生-物素之间的亲和力非常高，其解离常数在10?14 mol/L 数量级，是自然界最-强的非共价相互作用之一。因而常规的Streptavidin NUPharose FF填料与生-物素标记物质结合后，需要在变性条件下洗脱。在该使用方式下，样品易失活，填料的性能也受影响。

ee-SANUPharoseFF填料上的ee-SA配基经过基因工程改造后，保持了与生-物素的 特异性的同时，削弱了亲和力，因而可通过 D-生-物素竞争洗脱（图 1），扩展了链霉亲 和素填料的应用范围。图 2 为 ee-SANUPharoseFF 纯化生-物素化物质的过程，包含特异 性结合、D-生-物素竞争洗脱、NaOH 再生等环节。

4 、使用方法参考

 4.1 色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定 体积。ee-SANUPharoseFF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样

（1）缓冲液选择：一般选用pH6~8的结合缓冲液，常用缓冲液有10~100mM磷 酸钠缓冲液、20~200mM Tris-HCl缓冲液等，根据样品的稳定性，也可添加其他成分，如NaCl、还原剂、螯合剂等。若不确定最合适的缓冲体系，在初次使用ee-SANUPharose FF时，推荐使用20mM PBS（20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，调节pH 7.4）或20 mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0作为结合缓冲液。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。为保证缓冲液一致，可以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH 与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用方法有透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用结合缓冲液稀释2~10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。

（3）平衡：用结合缓冲液平衡5个柱体积，建议流速为~150 cm/h

（4）上样流速：推荐线性流速20~100 cm/h。较小的流速有利于载量的提高，可根据实际结合情况选择流速，能获得较好的效果。

（5）再平衡：上样后用结合缓冲液再平衡5~10个柱体积，或平衡至基线，洗去杂质，推荐流速为~150 cm/h。

4.3 洗脱

结合了生-物素化物质的ee-SANUPharoseFF可采用温和的方式洗脱，一般在结合缓冲液中加入1-10 mM的D-生-物素作为洗脱缓冲液，通过竞争的方法洗脱。

4.4 再生

（1）填料使用后需要再生，本产品耐受一定的碱性，推荐使用2~5个柱体积的 20-100 mM NaOH 溶液反向清洗柱子，进行再生，推荐流速为~150 cm/h。

（2）其他方法，比如 1-2M NaCl 、70%乙醇、30%异丙醇等，也可用于该介质的再生。

4.5 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8℃为宜，不可冻存。