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信帆生物:一氧化氮(NO)含量測定試劑盒說明書

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上海信帆生物供應(yīng):一氧化氮(NO)含量測定試劑盒!

一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量測定試劑盒說明書
100T/48S
注意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
NO(Nitric Oxide,NO)廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中,特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì),發(fā)揮信號傳遞的作用,是一種新型的生物信使分子,在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理:
NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO2—,在酸性條件下,NO2—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物,進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合,產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰,測定其吸光值,可以計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響,每個樣品需做對照管。
自備實驗用品及儀器:
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體3mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體3mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
樣品處理:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。10000g,4℃離心15min,取上清,置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心15min,取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品:直接測定。
測定步驟和操作表:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm。
2、操作表
對照管
測定管
樣品(μL)
100
100
試劑一(μL)
50
試劑二(μL)
50
試劑三(μL)
50
50
混勻,4℃室溫靜置15min,于微量石英比色皿/96孔板,對照管調(diào)零,測定550nm處吸光值,記為A550。
NO含量計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y= 0.016x -0.0103,R2= 0. 9986
1、組織樣品:
NO含量定義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2— ,相當(dāng)于1μmoL NO。
(1)按樣本質(zhì)量計算
NO含量(μmoL/g)=(A550 +0.0103)÷0.016×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×10-3
= 0.125×(A550 +0.0103)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
NO含量(μmoL/mg prot)=(A550 +0.0103)÷0.016×V反總÷(V樣×Cpr)×10-3
= 0.125×(A550 +0.0103)÷Cpr
2、其他樣品:
NO含量定義:25℃時,每升樣品15min生成1μmoL NO2— ,相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量(μmoL/L)=(A550 +0.0103)÷0.016×V反總÷V樣
= 125×(A550 +0.0103)
V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y= 0.008x - 0.0103,R2= 0. 9986
1、組織樣品:
NO含量定義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2— ,相當(dāng)于1μmoL NO。
(1)按樣本重量計算
NO含量(μmoL/g)=(A550 +0.0103)÷0.008×V反總÷(V樣÷V樣總×W)×10-3
= 0.25×(A550 +0.0103)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
NO含量(μmoL/mg prot)=(A550 +0.0103)÷0.008×V反總÷(V樣×Cpr)×10-3
= 0.25×(A550 +0.0103)÷ Cpr
2、細(xì)胞
NO含量定義:25℃時,每104 個細(xì)胞15min生成1μmoL NO2— ,相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量(μmol/104 cell)=(A550 +0.0103)÷0.008×V反總÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)×10-3
= 0.25×(A550 +0.0103)÷細(xì)胞數(shù)量(萬個)
3、 其他樣品:
NO含量定義:25℃時,每升樣品15min生成1μmoL NO2— ,相當(dāng)于1μmoL NO。
NO含量(μmoL/L)=(A550 +0.0103)÷0.008× V反總÷V樣= 250×(A550 +0.0103)
V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
注意事項:
1. 試劑盒2-8℃保存。
2. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測,試劑三有腐蝕性,操作時請做好防護措施。
3. 若檢測出得OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外,請將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋,并在計算公式中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。
4. zui低檢出限為0.65μmoL/L。

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