本文討論的范圍包括RNA酶保護(hù)分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因?yàn)楦鞣N書(shū)籍和kit說(shuō)明書(shū)上都有，主要說(shuō)一些原則，而且大部分是失敗和成功的經(jīng)驗(yàn)，還有小組討論結(jié)果以及各種書(shū)里七零八落看的內(nèi)容，希望對(duì)大家有用。

基因表達(dá)的定義：說(shuō)到基因表達(dá)，是指RNA，還是蛋白？是指mRNA還是包括風(fēng)頭正旺的非編碼RNA？mRNA還有不翻譯的RNA呢。應(yīng)該說(shuō)轉(zhuǎn)錄水平指的是RNA水平，而蛋白應(yīng)該叫翻譯水平？我們這里就特指編碼蛋白的mRNA的量的檢測(cè)吧！ 

方法：很多很多，我們常用的也就是RT-PCR和northern。RNA沒(méi)保護(hù)分析在國(guó)外很常用，也有半定量的功能，一次性試劑盒還能以此將一個(gè)表達(dá)簇一起分析，例如NFkB的轉(zhuǎn)錄激活譜中的8個(gè)常見(jiàn)基因。dot blot的zui大貢獻(xiàn)是發(fā)展到了反向dot blot的――曾經(jīng)無(wú)*髦的基因芯片，而原位雜交的放大效應(yīng)和它的假陽(yáng)性使它的定量（半定量，應(yīng)該根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意義不可同日而語(yǔ)，又難做，只有新發(fā)現(xiàn)的基因可以在沒(méi)有得到蛋白和抗體的情況下進(jìn)行組織或者細(xì)胞定位。

先談?wù)凴T-PCR吧。關(guān)于原位雜交和 dot blot大家可以和我論戰(zhàn)的，我曾經(jīng)看到一篇公開(kāi)發(fā)表的文章把dot blot稱為定量檢測(cè)，是錯(cuò)誤的。

1、模板均一性問(wèn)題：愚見(jiàn)采用從RNA定量的方法似不妥，不要說(shuō)PCR的本身的敏感度，即便是在反轉(zhuǎn)錄就有差異，到了cDNA的分裝和用于模板的取樣，這些都不能保證準(zhǔn)確，當(dāng)然在反轉(zhuǎn)錄階段我們也經(jīng)?？刂圃?或5ug，但這是為了再將來(lái)加樣的時(shí)候保證大致差不多，而且盡可能地利用反轉(zhuǎn)錄酶，而且RNA定量本身即使用電泳也不是那么準(zhǔn)，更不要說(shuō)分光光度計(jì)，這里說(shuō)一下，我曾經(jīng)看到有人說(shuō)用分光光度計(jì)定量，這也不是很準(zhǔn)確，分光光度計(jì)只是掌握大概，當(dāng)然用于反轉(zhuǎn)錄足夠了，但是用于rt－pcr的定量這是不正確的，很不準(zhǔn)的，RNA也至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計(jì)比較不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。 

2、RNA制備：一般制備總RNA 即可，有時(shí)需要制備mRNA，個(gè)人認(rèn)為初學(xué)者還是選擇Trizol，大量制備采用傳統(tǒng)的方法自己配，實(shí)際上和trozol一樣的，有時(shí)效果還好，trizaol也就是混一混，但是優(yōu)點(diǎn)在于質(zhì)量保證，使用方便，效率高，根據(jù)不同組織用trizol一般可以提到全部RNA的50%（別小看，這已經(jīng)很高了）以上，有些可以到達(dá)80%。mRNA用Qiagen的柱子，別去自己做Oligo（dT）柱，太麻煩。是否用DNAseI根據(jù)基因的特點(diǎn)和引物的設(shè)計(jì)，能夠跨內(nèi)含子的就不需要處理，處理還是很危險(xiǎn)的哦。像這樣的微量和也用不了多少次的實(shí)驗(yàn)，并且如果牽涉到樣品是*的時(shí)候，因該選好的進(jìn)口試劑。談到RNA的貯存實(shí)際上主要是溫度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要說(shuō)在胍里了，只－20是不夠的，至少－80，液氮zui保險(xiǎn)，想想，在低溫里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一種easy產(chǎn)品可用于保存標(biāo)本，但在常溫也只是1天，所以低溫才是首要的，抽的時(shí)候也是這樣。 

3、反轉(zhuǎn)錄：常規(guī)，取樣盡量一致，如上所述，不是為了定量，是為了半定量PCR時(shí)圖形的好看。選擇逆轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，少量的可用 Promega的一種1ug的酶，多的我們用invitrgen的5ug的II，當(dāng)然有人說(shuō)Promega和Roche的也不錯(cuò)，用過(guò)，的確可以，要不 Invitrogen不像當(dāng)初Gibco時(shí)那么牛了，也降價(jià)打折了。反轉(zhuǎn)錄成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你還曾經(jīng)72度滅活呢，是不是？要知道，雜合雙鏈比DNA雙鏈還穩(wěn)定的。一般來(lái)說(shuō)要擴(kuò)增從反轉(zhuǎn)錄到PCR全過(guò)程的長(zhǎng)達(dá)2kb以上的片斷是相當(dāng)困難的事，很多長(zhǎng)基因是通過(guò)隨機(jī)引物庫(kù)得到的而不是通過(guò)oligo （Td）得到的，不要說(shuō)反轉(zhuǎn)錄,即使是PCR也是很困難的，不信可以從質(zhì)粒里試試,至于反轉(zhuǎn)錄，就更是天方夜譚了，除了酶的效率等,還有RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，這就要一些大公司的特殊的名貴的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.聽(tīng)天由命吧。

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