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分子克隆知多少

*個人造生命細胞——Mycoplasma mycoides

2010年，借助于已知的基因組序列信息，偉大的JCVI研究所（J. Craig Venter Institute）的偉大的合成生物學博士Daniel Gibson及其同事精心設計、合成并巧妙組裝出完整的Mycoplasma mycoides基因組（大小為1.08Mbp），并將之轉(zhuǎn)移到不含任何基因組的受體細胞（Mycoplasma capricolum）中，進而人造出*個生命細胞——Mycoplasma mycoides細胞。令人驚奇的是，新的生命細胞表現(xiàn)出預期的表型特征，且具備自主復制的能力。需要特別提出的是：用于片段組裝的分子克隆技術及酵母同源重組技術功不可沒。

（圖1.The assembly of a synthetic M. mycoides genome in yeast. DOI: 10.1126/science.1190719）

與PCR、qPCR等技術一樣，作為分子實驗室*手段，分子克隆技術被廣泛用于多樣的基因功能研究。所謂分子克隆指的是在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入宿主細胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增殖能力和表達（現(xiàn)代分子生物學，第3版）。

分子克隆方法大全

分子克隆技術的發(fā)展經(jīng)歷3個階段，*階段為經(jīng)典的T4 DNA連接酶介導的TA克隆及粘性末端克隆，第二階段為基于DNA修飾酶的LIC系列克隆，第三階段為基于DNA重組酶的Gateway克隆及一步法克隆（該方法與Daniel Gibson等所發(fā)明的技術原理相同，原理詳見后面部分）。

分子克隆技術發(fā)展歷程

常見的分子克隆類型

1.基于T4 DNA連接酶的克隆

本系列克隆使用的酶類為：T4 DNA連接酶（和限制性內(nèi)切酶）。

T4 DNA連接酶作用：可以催化目的片段和載體zui后一位堿基上的5’磷酸基團和3’羥基形成磷酸二酯鍵，以實現(xiàn)將目的片段和載體連接成環(huán)狀質(zhì)粒。

限制性內(nèi)切酶作用：可以對目的片段和載體識別并切割出相同的粘性末端，用于堿基互補配對。

根據(jù)是否使用限制性內(nèi)切酶，可分為平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。

1.1平末端克隆/TA克隆

該方法可用于目的基因的測序或保存，或用于文庫構(gòu)建等。其克隆原理和過程如圖所示。

1.2粘性末端克隆

zui為傳統(tǒng)、zui為經(jīng)典的克隆方法，現(xiàn)在依舊被眾多實驗室廣泛使用。該克隆方法可用于構(gòu)建表達載體、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒等。

2.基于DNA修飾酶的克隆方法

今天所介紹的該系列克隆方法依賴的酶為：T4 DNA聚合酶。

T4 DNA聚合酶的作用：具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP時，表現(xiàn)為3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和載體，產(chǎn)生單鏈的DNA粘性末端；加入某一單獨dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，摻入與切割動態(tài)平衡，切割終止。

因此，T4 DNA聚合酶為基礎的克隆方法的關鍵是目的基因和載體間需要有一定數(shù)量的重疊序列。

2.1 LIC克隆法

通過T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性分別處理目的基因和載體的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生12nt的5'突出互補末端，利用突出的互補末端之間的退火進行基因克隆。12nt為人為額外添加。

克隆過程：

1、用5'端帶有重疊序列的特異性引物分別擴增目的DNA基因和載體，獲得帶有重疊序列的目的基因和線性化質(zhì)粒；

2、使用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性分別消化PCR擴增得到的目的基因和載體；

3、產(chǎn)生粘性末端后，添加某一成分dNTP，終止切割；

4、將帶有重疊序列的兩個片段進行退火，就形成了帶有切口的環(huán)狀質(zhì)粒；

5、轉(zhuǎn)化后，大腸桿菌內(nèi)的修復機制修復損傷的DNA分子，經(jīng)過復制得到大量目的質(zhì)粒。

2.2 SLIC克隆法

與LIC克隆不同，SLIC克隆中目的基因和載體的重疊序列使用的是載體末端序列，因此SLIC克隆為無縫克隆。

克隆過程：

1、用帶有重疊序列的特異性引物擴增目的基因，用限制性內(nèi)切酶或PCR擴增得到線性化質(zhì)粒；

2、T4 DNA聚合酶分別處理PCR擴增得到的目的基因和線性化質(zhì)粒一段時間；

3、產(chǎn)生粘性末端后，添加某一單獨dNTP終止反應，從而得到含有一段粘性末端的目的基因和線性化質(zhì)粒；

4、然后目的基因和線性化質(zhì)粒經(jīng)過變性、退火，得到帶有“缺口”的環(huán)狀質(zhì)粒；

5、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)過大腸桿菌體內(nèi)修復機制，獲得完整環(huán)狀質(zhì)粒。

3.基于重組酶的克隆方法

今天介紹的該系列克隆方法雖同為重組法克隆，但酶的性質(zhì)不同，故分開論述。

3.1 Gateway克隆法——實現(xiàn)基因在不同類型載體間“穿梭”

該技術依賴的酶：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大腸桿菌IHF因子。

該技術需要四個特異性重組位點（attB、aatP、attL、attR），引導發(fā)生兩個特異性重組反應（BP反應和LR反應）。

BP反應：將目的基因克隆進入入門質(zhì)粒。使用到的酶為Int和IHF。

LR反應：將入門質(zhì)粒中的目的基因轉(zhuǎn)移到終載體中，獲得表達載體。使用到的酶為Int、IHF及Xis。

終載體若帶有attR位點，則帶有attL位點的入門克隆便可以與之發(fā)生LR反應，進而將入門克隆的目的基因轉(zhuǎn)移到不同類型的終載體中。

3.2 一步法克隆——Daniel Gibson發(fā)明的分子克隆方法的“簡版”

該技術依賴的“重組酶”：核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及連接酶。

該技術的基礎同樣為：目的基因和載體之間需要15-20bp的重疊序列。

前文提到的LIC、SLIC等方法都要“粘性”末端暴露、添加dNTP終止和“粘性”末端退火等過程，操作繁瑣。而一步法克隆能夠在一個反應體系中實現(xiàn)“粘性”末端暴露、退火及片段的組裝。

3.5 TOPO克隆——zui快速、的克隆

Topo克隆技術依賴的酶為：兼具內(nèi)切酶活性與連接酶活性的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ。

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的作用：識別特定序列位點（CCCTT），并在2min內(nèi)對位點處完成80%的酶切連接反應。

因此，Topo克隆反應僅需2-5min完成。Topo克隆技術是潛力的克隆技術。

4.其他克隆方法

不同克隆方法的聯(lián)合使用，可實現(xiàn)快速的克隆。如使用一步法克隆將目的基因克隆進入入門載體后，與Gateway克隆結(jié)合可實現(xiàn)目的基因在不同終載體中的穿梭。同理，使用Topo克隆與Gateway克隆聯(lián)合亦可達到相同目的。

選擇*的克隆方法

HB170904