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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔呢？
2009年，Stephen A等人發(fā)表文章《The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments》，這是一群qPCR大牛經(jīng)過商討制定的qPCR實(shí)驗(yàn)和發(fā)表文章指南，其目的是為了作者根據(jù)指南提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，審稿人據(jù)此可以評價實(shí)驗(yàn)所用方法的可靠性，其他研究人員也可以利用這些信息進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
MIQE指南由9個部分組成，共涉及85個參數(shù)，以保證qPCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。這9 部分包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、靶標(biāo)基因、qPCR引物和探針、qPCR實(shí)驗(yàn)報告、qPCR合理性和數(shù)據(jù)分析。85個參數(shù)針對qPCR結(jié)果的重要性，分為了兩類：其中標(biāo)記為“E"表示必須(essential)，標(biāo)記為“D"表示建議(desirable)。
針對提取得到的RNA等核酸進(jìn)行量化十分重要，尤其是在比較分析不同樣本時，RNA等核酸投入一致或類似的數(shù)量能夠避免一系列不確定因素。另外RNA等核酸的質(zhì)量評估也必不。常見的量化和質(zhì)量評估方法有多種，最為常見的是分光光度法，但需要注意的是A260/A280比值必須在中性PH值buffer中進(jìn)行測量，吸光度比值會受到DNA或者殘余苯酚的影響而改變且不能評估核酸是否發(fā)生降解，故最好搭配其他檢測方法，例如瓊脂糖凝膠電泳、或者是參考基因/靶基因3‘：5’完整性檢測。如果RNA樣本部分降解，該信息在發(fā)表文章時需要告知，因?yàn)榈退睫D(zhuǎn)錄檢測的敏感性可能降低，其中降解帶來的差異可能會造成不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
RNA提取過程中也應(yīng)包括DNA酶處理步驟，用以去除相關(guān)的基因組DNA污染。建議對RNA樣本是否經(jīng)過DNA酶處理(包括DNase類型和反應(yīng)條件)等做好記錄。
核酸中雜質(zhì)殘留的檢測應(yīng)通過稀釋樣本做反轉(zhuǎn)錄以檢測反轉(zhuǎn)錄活性或PCR抑制程度，或者采用SPUD等抑制實(shí)驗(yàn)。
核酸的結(jié)構(gòu)(例如莖環(huán)二級RNA結(jié)構(gòu))對于反轉(zhuǎn)錄和PCR的效率有著重要的影響。故而引物、探針和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的位點(diǎn)需考慮到RNA的折疊。
引物的特異性需用直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證有效性，例如凝膠電泳、熔解曲線、DNA測序、擴(kuò)增子大小、和/或限制性酶切驗(yàn)證。一些引物優(yōu)化的證據(jù)或方案最好也可提供，理想的形式是退火溫度梯度或Mg2+濃度梯度摸索并以Cq值、熒光與循環(huán)曲線圖的形式呈現(xiàn)數(shù)量和/或熔解曲線。
所有qPCR反應(yīng)都需要進(jìn)行額外的質(zhì)控或定量標(biāo)準(zhǔn)品，例如使用NTC檢測PCR污染。每96孔板或每批樣品上樣應(yīng)包括NTC，并確定數(shù)據(jù)不符合的條件，舉個例子，如果未知低濃度的Cq值為35，則可以忽略Cq值≥40的NTC。
4.1擴(kuò)增效率
穩(wěn)定和精確的熒光定量PCR檢測通常和高效的擴(kuò)增效率相關(guān)。尤其當(dāng)檢測經(jīng)內(nèi)參基因校準(zhǔn)的目的基因mRNA濃度時，擴(kuò)增效率尤為重要?！鳌鰿q法是測定樣品間不同基因表達(dá)情況用的方法之一，是基于單個內(nèi)參基因的校準(zhǔn)進(jìn)行的。計(jì)算靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Cq值的差異，并直接比較不同樣本之間的△Cq，這種情況需要兩個基因能以可比的效率進(jìn)行擴(kuò)增，方能進(jìn)行比較。
擴(kuò)增效率必須通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定，因?yàn)檫@種校準(zhǔn)方法提供了一個簡單、快速以及可重復(fù)擴(kuò)增效率、分析敏感性和實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的平均指標(biāo)。擴(kuò)增效率根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對數(shù)線性部分的斜率確定。每個靶標(biāo)基因的的標(biāo)準(zhǔn)曲線需提交在稿件中，這樣審稿人能夠看到。
4.2線性動態(tài)范圍
根據(jù)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板，動態(tài)范圍應(yīng)至少包括3個數(shù)量級，理想狀態(tài)是5或6 Log10濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)間需包括被定量的靶標(biāo)基因的區(qū)間。由于定量下限通常定義不明確，應(yīng)當(dāng)確定線性區(qū)間內(nèi)低濃度的變化。同時需要展示相關(guān)系數(shù)(R2 值)
4.3靈敏度(LOD)
LOD的定義是可以檢測到95%的陽性樣品的低濃度。換言之，在一組含有目的基因的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，在LOD濃度下，不應(yīng)發(fā)生超過5%的失敗反應(yīng)。實(shí)際上，我們可以通過有限稀釋法來檢測，失敗和成功反應(yīng)的百分比覆蓋泊松分布即可。
4.4精度
熒光定量PCR結(jié)果的變化有多種原因，包括溫度的差異可影響退火或變性，移液誤差引起的濃度差異和隨機(jī)變化。qPCR精度和濃度相關(guān)，一般隨著拷貝數(shù)的降低而降低。理想情況下，實(shí)驗(yàn)內(nèi)的重復(fù)性應(yīng)當(dāng)以SD error bar或具有重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的CIs的形式顯示在圖中。CVs不應(yīng)與Cqs一起使用，但可用于表達(dá)拷貝數(shù)或濃度的差異。
多重實(shí)驗(yàn)大大擴(kuò)展了qPCR分析的能力，特別是應(yīng)用于同時檢測點(diǎn)突變或多態(tài)性檢測。多重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)需要證明多個靶標(biāo)的準(zhǔn)確量化在同一管中不會受到干擾，即，擴(kuò)增效率和靈敏度和進(jìn)行單重實(shí)驗(yàn)時是一致的。這點(diǎn)當(dāng)豐度較低的靶標(biāo)基因和豐度高的靶標(biāo)基因進(jìn)行共同擴(kuò)增時尤為重要。
數(shù)據(jù)分析包括對原始數(shù)據(jù)的檢查、對數(shù)據(jù)質(zhì)量和可靠性的評估，以及生成可報告的結(jié)果。
均一化是進(jìn)行科學(xué)qPCR分析的一個重要組成部分，該過程控制核酸抽提效率、反轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增效率的變化，從而能夠比較不同樣本的RNA濃度。使用內(nèi)參基因作為內(nèi)部對照是最常見的均一化RNA數(shù)據(jù)的方法。均一化包括靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因的RNA濃度之比。內(nèi)參基因的RNA應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)，其基因豐度與樣品中mRNA總量呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)。
均一化通常不能用一個內(nèi)參基因，除非作者可為審稿人提供明確的證據(jù)證實(shí)內(nèi)參基因在其實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)恒定。內(nèi)參基因的最佳數(shù)目和選擇需通過文章具體實(shí)驗(yàn)確定并報告方法。
生物體本身固有的變異性可能與組間的實(shí)驗(yàn)差異相匹敵，甚至超過后者。尤其是使用許多生物學(xué)重復(fù)來提高實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)重要性時，這種變化就變得顯而易見。雖然生物重復(fù)間的差異可能很大，但是足夠數(shù)量的樣本可以減少實(shí)驗(yàn)差異性。許多因素會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)變異，從而影響到達(dá)統(tǒng)計(jì)所需的生物重復(fù)的數(shù)量。因此，功效分析(power analysis)有助于確定有效可靠結(jié)論所需的樣本數(shù)。
使用PCR僅檢測核酸是否存在，而不是對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，被稱為定性PCR，該方式廣泛應(yīng)用于病原體診斷。PCR方法定性/定量分層問題在于，準(zhǔn)確回答是或否，需要低敏感性PCR實(shí)驗(yàn)的敏感性信息。因此，即使是定性分析也應(yīng)提供有關(guān)分析能力的相關(guān)信息。
建議將縮寫qPCR用于real-time PCR，并將RT-qPCR用于反轉(zhuǎn)錄-qPCR。將RT-PCR簡稱為qPCR會引起混淆，并且與傳統(tǒng)RT-PCR的應(yīng)用不符。
內(nèi)參基因
內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
TaqMan探針應(yīng)指為水解探針(hydrolysis probes)。
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機(jī)制，指發(fā)射/猝滅依賴于兩個熒光染料分子的電子激發(fā)態(tài)之間相互作用。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當(dāng)?shù)?，而不是quantitation。
現(xiàn)在文獻(xiàn)中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(diǎn)(crossing point, Cp)和分支點(diǎn)(take-off point, TOP) 與PCR循環(huán)的術(shù)語不一致。這些術(shù)語指的實(shí)際上是相同的值，只是由于不同儀器廠家由于產(chǎn)品差異化的原因造成的，不具有科學(xué)的準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)RDML（Real-Time PCR Data Markup Language）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，建議統(tǒng)一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個術(shù)語。
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
動物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
簡單植物總RNA提取，避開有毒試劑，最快40min完成 | MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒 | 19291ES | |
多糖多酚植物總RNA提取，最快30min完成 | MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | 19292ES | |
細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快8 min完成 | MolPure® Cell RNA Kit 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒 | 19231ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
定量預(yù)混液 (染料法)，已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到5000+ | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11201ES | |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11202ES | ||
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11203ES | ||
高靈敏型qPCR預(yù)混液（染料法） | Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11198ES | |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11199ES | ||
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11200ES | ||
miRNA加A法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） | 11171ES | |
miRNA莖環(huán)法高特異性定量預(yù)混液(染料法) | Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（莖環(huán)法） | 11170ES | |
高靈敏一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒(染料法) | Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit | 11143ES | |
細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR，1.5 h從細(xì)胞到基因表達(dá)分析(染料法) | Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit | 11172ES | |
反轉(zhuǎn)錄試劑 | 5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-示蹤版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11149ES |
5 min快速反轉(zhuǎn)，最長可滿足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR)-常規(guī)版New | Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） | 11150ES | |
15 min一步完成gDNA去除與反轉(zhuǎn)錄(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR | 11142ES | |
鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
最長可滿足19.8 kb cDNA合成試劑盒，含gDNA去除(下游應(yīng)用PCR/qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) | 11139ES | |
常規(guī)30 min反轉(zhuǎn)預(yù)混液,含gDNA去除（下游應(yīng)用qPCR） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES | |
miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（加A法） | Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） | 11148ES |
