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在全球范圍內(nèi)，乳腺癌(BC)是女性中最常被診斷出的惡性腫瘤，廣泛了解正常乳房發(fā)育、癌變和疾病進(jìn)展的潛在過(guò)程對(duì)于設(shè)計(jì)新的個(gè)性化療法是必要的，但由于缺乏合適且廣泛可用的體外模型阻礙了這一過(guò)程。
類(lèi)器官是一種在體外3D培養(yǎng)并模擬體內(nèi)器官的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以更準(zhǔn)確地保留體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。乳腺類(lèi)器官可以準(zhǔn)確再現(xiàn)體內(nèi)乳房微環(huán)境，并已被用于檢查影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和組織重塑的因素。
我們根據(jù)Clevers H發(fā)表的兩篇文章[1][2]，整理了乳腺組織生成乳腺類(lèi)器官的培養(yǎng)方案。該模型可用于長(zhǎng)期培養(yǎng)源自正常人乳腺組織或乳腺癌組織的類(lèi)器官。
圖1.乳癌組織分化為乳腺類(lèi)器官的過(guò)程(PMID: 33692550)[2]
1.1將每個(gè)組織樣本(<3-4 cm3)轉(zhuǎn)移到裝有D-BSA（DMEM GlutaMAX培養(yǎng)基中加入終濃度0.1%不含脂肪酸的BSA）的50 mL Falcon試管中，手術(shù)刀將組織切成0.5-1 mm3小塊（組織塊看起來(lái)均勻且有點(diǎn)粘稠）；
1.2 D-BSA重懸洗滌幾次，靜置后去除上清
1.3加入Type I型培養(yǎng)基，混勻，然后加入終濃度1 mg/mL的II型膠原酶和10 μM Y-27632，37°C消化1-2 h；
1.4 加入FBS終止消化，通過(guò)100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，450 g離心5 min去除上清；
1.5 如果沉淀物部分呈紅色，加入紅細(xì)胞裂解緩沖液，室溫下孵育2 min，然后加入D-BSA，450 g離心5 min去除上清。
2.1 BME（基底膜提取物，也可用Matrigel替換）中重新懸浮細(xì)胞沉淀，混勻后，逐滴滴在12孔板中鋪板，37°C倒置固化；
圖2.BME滴在12孔板中的代表性圖像(PMID: 33692550)[2]
2.2 添加適量的Type I型(Advanced DMEM/F12，10% R-spondin1-conditioned medium，10% Noggin-conditioned medium，1×B27+VitA，10 mM Nicotinamide，1.25 mM N-acetyl-L-cysteine，100 μg/mL Primocin，5 μM Y-27632，5 nM Heregulin B1，5 ng/mL FGF-7，20 ng/mL FGF-10，0.5 μM A83-01，5 ng/mL EGF，1 μM SB202190)或Type II型培養(yǎng)基(Advanced DMEM/F12，20% Wnt3a-conditioned medium，10% R-spondin1-conditioned medium，10% Noggin-conditioned medium，1×B27+VitA，10 mM Nicotinamide，1.25 mM N-acetyl-L-cysteine，0.5 μg/mL Hydrocortisone，100 nM β-estradiol，10 μM Forskolin，100 μg/mL Primocin，5 μM Y-27632，5 nM Heregulin B1，20 ng/mL FGF-10，0.5 μM A83-01，5 ng/mL EGF)，37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2-4天更換一次培養(yǎng)基，7-21天后可進(jìn)行類(lèi)器官傳代。
圖3.用Type I型或Type II型培養(yǎng)基得到的乳腺類(lèi)器官明場(chǎng)圖像(PMID: 33692550)[2]
圖4.乳腺類(lèi)器官代表性明場(chǎng)圖像，太稀疏（左）、太密集（中）或密度適中（右）(PMID: 33692550)[2]
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號(hào) | 規(guī)格 | 簡(jiǎn)介 |
Y-27632 | 53006ES | 1 mg/5 mg/10 mg | ROCK抑制劑 |
Nicotinamide煙酰胺 | 51402ES | 1 g/5g | sirtuins的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 |
N-Acetyl-L-cysteine | 50303ES | 2 g | 抗氧化劑 |
A83-01 | 53002ES | 1 mg/5 mg/10 mg | ALK5抑制劑 |
SB202190 | 53005ES | 5 mg/10 mg/25 mg | p38 MAPK抑制劑 |
Forskolin | 51001ES | 10 mg/50 mg/100 mg | 提供cAMP水平 |
β-estradiol β-雌二醇 | 60802ES | 250 mg/1 g | 雌激素 |
B-27 supplement,serum free,50X | 60703ES | 10 mL | 無(wú)血清添加劑 |
human EGF | 92708ES | 100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF10 | 91306ES | 5 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human FGF7 | 91304ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
human NRG1-beta1 | 92711ES | 10 μg/100 μg/500 μg | 重組蛋白 |
Bovine Serum Albumin(BSA),Fatty Acid Free | 36104ES | 25 g/100 g/500 g/1 kg | 用于細(xì)胞培養(yǎng) |
[1] Sachs N, et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 2018 Jan 11;172(1-2):373-386.e10.
[2] Dekkers JF, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nat Protoc. 2021 Apr;16(4):1936-1965.
