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這才是CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)！
導(dǎo) 讀
2021年8月5日，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)在Nature Chemical Bilology發(fā)文稱(chēng)開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR的核酸檢測(cè)新技術(shù)來(lái)檢測(cè)xin guan，最快20min完成檢測(cè)，較于傳統(tǒng)的RT-qPCR檢測(cè)方法更快速，這是CRISPR在病毒檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用的又一大進(jìn)步。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)即成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，它與Cas(CRISPR associated)蛋白組成的系統(tǒng)作為新一代的基因編輯工具，在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表觀遺傳修飾及3D基因結(jié)構(gòu)改變中得到廣泛的應(yīng)用[1]。
▲ 基因剪刀CRISPR（圖片來(lái)源網(wǎng)絡(luò)）
CRISPR/Cas的應(yīng)用
? 藥物靶點(diǎn)的確定與驗(yàn)證
? 基因環(huán)路上下游調(diào)控機(jī)制分析
? 代謝通路調(diào)節(jié)機(jī)制分析
? LncRNA作用機(jī)制分析
? 核酸檢測(cè)
CRISPR/Cas9系統(tǒng)
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是包含單鏈RNA的sgRNA，利用與sgRNA的5'端互補(bǔ)的序列將Cas9蛋白引導(dǎo)至目標(biāo)DNA位點(diǎn)。Cas9 Nuclease對(duì)目標(biāo)DNA序列的PAM依賴(lài)性識(shí)別并在PAM區(qū)上游3bp的特定位點(diǎn)啟動(dòng)DNA切割。
Cas9 Nuclease生成的雙鏈斷裂可通過(guò)NHEJ（Non-homologous end joining）或HDR（Homology directed repair）修復(fù)，NHEJ修復(fù)通常導(dǎo)致indel突變和基因失活，而HDR可以在提供供體模板時(shí)實(shí)現(xiàn)高保真的精確基因組編輯。由于生物體具有自我修復(fù)機(jī)制，隨著細(xì)胞復(fù)制分裂并修復(fù)切口，在修復(fù)的過(guò)程可能產(chǎn)生錯(cuò)配，移碼突變、缺失突變，最后篩選出錯(cuò)配純合子。
圖2：An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing[2]
CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的關(guān)鍵
? 如何減少和避免脫靶：
采用nick形式的Cas9 Nuclease加雙鏈sgRNA。
? sgRNA靶點(diǎn)的選擇：
Cas9 Nuclease切割位置在待修飾位點(diǎn)的30bp以?xún)?nèi)，Z差保持在50bp以?xún)?nèi)。
? sgRNA品質(zhì)：
sgRNA活性是影響KI的關(guān)鍵因素之一，因此需要提前驗(yàn)證其活性。
? Cas9 Nuclease形式的選擇：
縮短Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存續(xù)時(shí)間，可以避免連續(xù)切割和脫靶，建議使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用質(zhì)粒，需要確保其純度和濃度（建議大于1μg/μl）。
翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“翌圣生物"）經(jīng)過(guò)匠心研發(fā)，開(kāi)發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計(jì)的特異性DNA序列，可在單管反應(yīng)4小時(shí)內(nèi)獲得20-100μg具有功能的高品質(zhì)的sgRNA，具有合成效率高、品質(zhì)好、切除效率高等特點(diǎn)。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit 測(cè)試數(shù)據(jù)
較高濃度的sgRNA關(guān)系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗，因此只有加入高濃度的sgRNA方能對(duì)基因的編輯起較好效果。翌圣生物開(kāi)發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計(jì)的特異性DNA序列，可在單管反應(yīng)4小時(shí)內(nèi)獲得20-100μg，*基因編輯的需要。
圖3：不同時(shí)間的sgRNA的合成量
對(duì)于sgRNA Synthesis Kit不僅要滿(mǎn)足產(chǎn)量上的要求，還需要針對(duì)不同種類(lèi)的sgRNA合成也要達(dá)到相當(dāng)高的產(chǎn)量，方能滿(mǎn)足不同類(lèi)型基因的編輯需要，擴(kuò)大試劑盒的應(yīng)用范圍。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit經(jīng)過(guò)多個(gè)種類(lèi)的sgRNA的合成，其產(chǎn)量也是很高，可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)所需，因此可以適應(yīng)多種基因的編輯需要。
圖4：不同種類(lèi)的sgRNA的合成量
在影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗的關(guān)鍵因素中，合成的sgRNA的品質(zhì)也是關(guān)鍵一環(huán)。因?yàn)楹铣傻膕gRNA的純度（即品質(zhì)）不好，對(duì)編輯的效率會(huì)產(chǎn)生很大影響。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA經(jīng)過(guò)安捷倫2100測(cè)定，其純度單一，說(shuō)明品質(zhì)較高，對(duì)后續(xù)的編輯效率會(huì)有很大提升。
圖5：合成的sgRNA的品質(zhì)（安捷倫2100測(cè)定）
最后，所合成的高品質(zhì)sgRNA是否有活性，需要實(shí)地測(cè)定才能發(fā)現(xiàn)其是否有活性，是否能夠與Cas9 Nuclease進(jìn)行組合達(dá)到編輯基因的目的。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA與Cas9 Nuclease進(jìn)行組合體外切割靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導(dǎo)Cas9 Nuclease在特定位點(diǎn)切割并產(chǎn)生特定大小的DNA片段，因此具備活性。
圖6：sgRNA的剪切效率效果圖
翌圣生物為您提供高品質(zhì)、高性?xún)r(jià)比的sgRNA合成試劑盒，讓您的CRISPR/Cas9科學(xué)研究及相關(guān)基因編輯應(yīng)用如虎添翼，共同為人類(lèi)的未來(lái)健康奉獻(xiàn)一份力量。
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產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES50/60 | 50/100T |
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Hieff Trans™ siRNA/miRNA 體外轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES02/03 | 0.5/1 mL |
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【1】王晗月,楊曉菲,胡巢鳳,李富榮. CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在糖尿病細(xì)胞治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué),2019,07:723-73.
【2】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214.
