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PCR-Free建库，你get到了吗？
高通量测序中，常规的文库构建需要PCR扩增，一方面，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，另一方面，可以放大荧光信号，让测序仪更容易捕获和识别荧光信号，提高测序准确度。但是，PCR就像一把“剑"，在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时，却也引入了扩增错误和偏向性，不能地呈现基因组序列“真实面貌"。因此，PCR-Free技术的引入，既具备了PCR的优势，也克服了PCR的缺点。
什么是PCR-Free技术？
常规NGS文库构建的核心步骤为：基因组打断-末端修复-加接头-PCR-测序前信号放大。那么，PCR-Free建库又是怎样的呢？顾名思义，就是不需要PCR的建库过程。其文库构建的核心步骤为：基因组打断-末端修饰-加接头-文库质控。但事实上，这只能算是建库环节的PCR-Free。真正的PCR-Free，应该是从建库到测序全流程均无文库扩增的过程（例如单分子测序技术）或者无PCR扩增错误累积的测序技术（例如MGI的DNBseq）。
图1：常规建库与PCR-Free建库流程图
PCR-Free技术优势
在常规建库过程中，扩增酶存在引入错误的可能，通过循环扩增, 这些错误会被积累放大，降低了DNA序列复制的保真性。此外，DNA聚合酶还具有一定的扩增偏向性，尤其是针对GC含量差异大或者二级结构等区域，扩增效率低，覆盖均一性差；在引入错误InDel的同时，还会带来大量的Duplication，造成DNA数据量的浪费，增加测序成本。而PCR-Free技术则能很好地规避常规建库中因PCR扩增而引入的上述问题，具体优势如下图所示。
图2：PCR-Free技术优势
PCR-Free数据展示
1.华大平台Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit （Cat#13321）PCR-free建库，相同投入量，不同的打断时间，均能获得良好的纯化回收率和环化效率。具体数据如下表：
表1：MGI平台PCR-Free建库数据
建库方法 | 打断酶 | 打断时间（min） | gDNA投入量 （ng） | 纯化回收率 | ERA投入量 （ng） | ssCir总量 （ng） | 环化效率 |
PCR-free建库 | Yeasen | 7 | 200 | 46.50% | 93 | 20 | 21.51% |
8 | 200 | 42.50% | 85 | 15 | 17.65% | ||
9 | 200 | 44.00% | 88 | 18 | 20.45% | ||
9 | 200 | 41.75% | 83.5 | 21.5 | 25.75% |
2.Illumina平台Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit（Cat#12204）与En*建库试剂盒进行PCR-Free建库实验。上机测序数据结果显示：12204测序数据更佳。
表2：Illumina平台PCR-Free测序数据
建库方法 | 试剂盒 | 酶切时间（min） | gDNA投入量（ng） | 接头连接产物（ng） | 双轮分选产物（ng） |
PCR-Free建库 | 12204 | 12 | 500 | 380 | 76 |
En* | 15 | 500 | 420 | 81 |
clean_base (G) | clean_q20 (%) | clean_q30 (%) | clean/raw (%) | map_ratio (%) | Adapter (%) | Dup (%) | GC (%) | Depth | Coverage (%) |
42.5196 | 98.597 | 95.505 | 95.38 | 99.54 | 4.73 | 7.3646 | 41.218 | 14.77 | 99.3671 |
17.0161 | 98.497 | 95.279 | 93.34 | 99.57 | 3.67 | 5.4718 | 41.203 | 5.89 | 97.4356 |
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