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                                 — — 生物化学发光检测法（荧光素酶） 

活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。

常见的荧光素酶有两种，分别是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，编码基因是luc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，编码基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它们共同的作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光（不同底物光的颜色和波长不同），当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。 

D-Luciferin：有三种，分别是D-Luciferin, Sodium Salt/D荧光素钠盐、D-Luciferin, Potassium Salt/D-荧光素钾盐和D-Luciferin Firefly,free acid/D-萤火虫荧光素YEASEN公司提供几种常用类型的D-Luciferin，每批试剂都经过严格的质量验证（经9次独立的HPLC和FTIR标准法监测）和发光效率检测，确?？突看问匝榈母咧馗葱院统晒π?。所有产品都可用于体内成像分析和体外化学发光检测实验。YEASEN的D-Luciferin是合成的萤火虫荧光素，结构与promega公司提供的甲虫荧光素一致，是水溶性的萤火虫荧光素酶底物。

（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D荧光素钠盐

分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 纯度：高级纯（99.7%）
应 用：1）体外化学发光分析（in vitro）；2）活体成像实验（in vivo）；3）高灵敏度ATP分析；
步 骤：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）用33.3 mL蒸馏水溶解1.0 gD-荧光素钠盐，配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）?；煸群罅⒓词褂没蚍肿昂?20℃冻存。
2）用组织培养基1∶200稀释储存液，配置工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基。
4）待图像分析前，向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活体成像分析
1）用无菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钠盐工作液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取决于注射方式，具体如下：

3）注射入体内5-10分钟后，进行成像分析。

（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-荧光素钾盐

分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 纯度：高级纯（99.7%）
应用：
1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 体外生物发光检测
1）配制成100 mM的储存液（200×，浓度30mg/ml）?；煸群罅⒓词褂没蚍肿昂?20℃冻存。
2）用预热好的组织培养基1∶200稀释储存液，配制工作液(终浓度150μg/mL)。
3）去除培养细胞的培养基直至无残留。
4）图像分析前立即向细胞内添加1×荧光素工作液，然后进行图像分析（或者细胞放在37℃短时间孵育后检测可增强信号）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活体成像分析
1）用无菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-荧光素钾盐溶液(15mg/mL)，0.2um滤膜过滤除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g体重的浓度向每支小鼠注射相应量的15mg/mL荧光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后进行成像分析。（对每只动物模型做荧光素动力学研究以确定峰值信号获取时间）

（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-萤火虫荧光素

分子式：C11H8N2O3S2 分子量：280.330 g/mol 外观：白色至浅黄色粉末
溶解：0.25%浓度溶解于甲醇，形成近乎无色至浅黄色的清夜
保存：-15°C 避光
应用：
1）活细胞、组织或生物体内luc标记基因和荧光素酶-融合基因体内/体外表达的成像分析；
2）广泛用于报告基因分析，免疫分析和ATP荧光卫生监测分析；

应用实例：

活体成像检测CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T细胞对小鼠皮下注射HN4细胞成瘤的治疗作用（Mei Z et al. Cancer Med. 2020 ）

使用荧光素（Luciferin）发表的文献:

[1] Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.

[2] Tang Y, Lin S, Yin S, Jiang F, Zhou M, Yang G, Sun N, Zhang W, Jiang X. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020 Feb;232:119727. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119727. Epub 2019 Dec 24. PMID: 31918223.

[3] Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.

[4] Zhou Y , Zhou C , Zou Y , Jin Y , Han S , Liu Q , Hu X , Wang L , Ma Y , Liu Y . Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis. Biomater Sci. 2020 Sep 21;8(18):5029-5046. doi: 10.1039/d0bm00840k. Epub 2020 Aug 19. PMID: 32812957.

[5] Ni XR, Zhao YY, Cai HP, Yu ZH, Wang J, Chen FR, Yu YJ, Feng GK, Chen ZP. Transferrin receptor 1 targeted optical imaging for identifying glioma margin in mouse models. J Neurooncol. 2020 Jun;148(2):245-258. doi: 10.1007/s11060-020-03527-3. Epub 2020 May 13. PMID: 32405996.

[6] Wu D, Lv J, Zhao R, Wu Z, Zheng D, Shi J, Lin S, Wang S, Wu Q, Long Y, Li P, Yao Y. PSCA is a target of chimeric antigen receptor T cells in gastric cancer. Biomark Res. 2020 Jan 28;8:3. doi: 10.1186/s40364-020-0183-x. PMID: 32010446; PMCID: PMC6988264.

[7] Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 as a target for CAR-T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020 Jan;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 Dec 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.

[8] Hu H, Zhang Z, Wang R, Wang Y, Jin J, Cai L, Yang J, Duan H, Wu Z, Fang Z, Liu B. BGC823 Cell Line with the Stable Expression of iRFP720 Retains Its Primary Properties with Promising Fluorescence Imaging Ability. DNA Cell Biol. 2020 May;39(5):900-908. doi: 10.1089/dna.2019.5057. Epub 2020 Feb 25. PMID: 32096664.

[9] Qiu J , Peng P , Xin M , Wen Z , Chen Z , Lin S , Kuang M , Fu Y , Fang G , Li S , Li C , Mao J , Qin L , Ding Y . ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020 Jun 7;8(11):3147-3163. doi: 10.1039/d0bm00147c. Epub 2020 May 4. PMID: 32363359.

[10] Zhao XY, Jiang Q, Jiang H, Hu LJ, Zhao T, Yu XX, Huang XJ. Expanded clinical-grade membrane-bound IL-21/4-1BBL NK cell products exhibit activity against acute myeloid leukemia in vivo. Eur J Immunol. 2020 Sep;50(9):1374-1385. doi: 10.1002/eji.201948375. Epub 2020 Jun 3. PMID: 32357256.

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YEASEN提供三种coelenterazine类似物，分别是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。虽然三种都可用于相同实验，但是得到的结果有差异。
Coelenterazine：普遍认为是天然的腔肠荧光素，是海肾荧光素酶（Rluc）的作用底物，具有许多用途。可用于检测活细胞中钙离子浓度，基因报告分析，BRET（生物发光共振能量转移）研究，ELISA，HTS，组织或细胞中超氧阴离子和过亚硝酸盐的化学发光检测。
Coelenterazine h:与Renilla荧光素酶或Gaussia荧光素酶使用具有一定的局限性。体外研究中比其他类似物更适合与钙离子激活发光蛋白共用。据报道，Coelenterazine h的发光强度高于天然腔肠荧光素10-20倍，因此是用来检测钙离子浓度微小变化的有力工具。
Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的底物，此腔肠素衍生物在390 nm和400nm之间发蓝色光，对GFP acceptor的光发射干扰最小。

（1）Coelenterazine（天然腔肠荧光素）

分子式：C26H21N3O3 分子量: 423.48 g/mol 纯度：95% 保存：-15°C避光，保存在惰性气体下
Protocol：发光检测实验
1）使用管光度计室温下定量检测发光情况，每个样品做三个平行；
2）加入底物10s内立即检测，“integration time"为1 s；
3）对于细菌表达Gluc系统，甲醇溶解底物腔肠素制备10 mM储存液，终浓度为10μmol/L。储存液-20 °C保存，工作液制备过程需避光并置于冰上。 

（2）Coelenterazine 400 a/腔肠素400a

分子式：C26H21N3O 分子量：: 391.48 g/mol 纯度：95%
储存液制备：
1）开封前将瓶子放到室温温育，以避免产品发生任何的冷凝；
2）用125 μL无水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，最终浓度是0.4μg/μL. ，轻轻混匀；（注：避免用DMSO或其他溶剂来溶解腔肠素400a，因为试剂可能被氧化）
3）分装后避光保存在-20°C，保持干燥； 

（3）Coelenterazine h/ 腔肠素h（from Caliper LifeScience Inc.）

RediJectCoelenterazineh为即用的注射型生物发光底物，特别设计用于体内成像研究。通过最小化产品成分的变化，最小化冻融次数和严格控制不同批次的产品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能确保客户得到高重复性的结果。
优 点：
◆预制配方，不同批次间严格控制特别设计用于体内研究；
◆即用型产品通过最小化预成像准备步骤，减少时间和精力；
◆每瓶可用于5只动物的成像研究；（10 瓶/kit）
◆经IVIS成像系统验证，控制体内成像质量；
颜色：黄色溶液（溶于丙二醇/柠檬酸盐）
浓度：150 μg/mL （10瓶无菌溶液，每瓶含1.2 mL浓度为150 μg/mL的Coelenterazine h ）
保存： Store at ≤ -70 °C。
使用及注射剂量：
开始实验前，37 °C水浴锅解冻，避免重复冻融。静脉注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1.   静脉注射：推荐使用剂量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接从瓶内吸取溶液，然后用25 gauge或更高的针头注射入小鼠体内。尽快成像检测以获得峰值信号。

2.   腹腔注射：推荐剂量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

应用实例：

Figure 1. RedijectCoelenterazine has been optimized for in vivo use with IVISimaging systems. (A) 5 pmol BRET Qdot 700* were injected intravenouslyin a nu/nu mouse. 10 minutes post BRET Qdot injection 15 μg/mouseCoelenterazine h was injected intravenously. Chart shows peak signal wasobserved right after injection at ~ 22 seconds followed by rapidclearance. Images were taken with IVIS kinectic. (B) 1,2 and 4 pmol BRETQdot 655 were injected subcutaneously in a nu/nu mouse. 10 minutes postBRET Qdot injection 10 μg/mouse Coelenterazine was injectedintraperitoneally. Chart shows that peak signal was reached around 27minutes post i.p. injection of Coelenterazine.

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