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磁珠深度解析，真的非AMPure XP不可吗？
引文：
基因测序越来越得到临床的认可，尤其是精准医疗概念提出以后，更是备受青睐，为精准治疗解答很多未知的问题。高通量测序技术的跨越式发展，使测序能力大幅上升，在整个NGS工作流程中，磁珠是*的产品。磁珠通过磁颗?；钚曰旁谝欢ㄌ跫驴捎牒怂峤岷虾徒饫氲脑?，将样本中目的片段分离?？墒迪侄院怂嵫镜母咄孔远僮?，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。
一、磁珠简述
1. 背景介绍
磁珠的发明构想初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad 。后期经过不断地创造与改善，目前我们zui常见的磁珠是纳米级别的磁珠，这类磁珠各式各样，根据其表面性质的不同，分离的原理也不尽相同，但其材料组成和基本的结构并无太大的差异?；〗峁狗治?，内层的是聚苯乙烯，第二层包裹磁性物质Fe3O4，外层是修饰的官能团（如羧基）。其中官能团能与核酸结合，表面基团不同，下游的应用也不尽相同，如核酸提取，纯化，生物素捕获等。
图1. 磁珠结构示意图
2. 原理解读
商业化磁珠产品体系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、盐离子等。在整个体系中，影响DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和浓度、孵育时间等，其中PEG是影响DNA回收的决定性因素。DNA在较高浓度的PEG和NaCl中脱去分子水化层，分子构象由线状被压缩成卷曲球状，并暴露出大量带负电荷的磷酸基团，带负电荷的磷酸基团与羧基在Na+的作用下形成“电桥"，使DNA被特异吸附到磁珠表面。当PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除三者间的离子作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 此外，不同长度的DNA随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，可以被选择性的沉淀出来。
图2. 磁珠吸附DNA原理示意图
二、磁珠应用
磁珠凭借其高通量，适用于自动化的特点在高通量测序中备受推崇，并广泛用于NGS建库中DNA的提取、纯化和分选。
1. 核酸提取
磁珠法提取中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解，并使与核酸结合的蛋白质变性。核酸被游离释放，携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，去除DNA/RNA以外的蛋白质、多糖等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA/RNA，洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA 或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。
图3. 磁珠核酸提取流程示意图
2. DNA纯化
DNA纯化的目的在于去除不想要的DNA段。由于磁珠优先吸附大片段，因而可通过一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丢弃上清中的非目标片段，之后将磁珠吸附的目的DNA洗脱回收。常用于小片段如接头二聚体/引物二聚体的去除。此外还有一些客户会用于样本的富集。
图4. DNA纯化流程示意图
DNA样本经磁珠纯化后会有部分样本的损失，磁珠回收效率可评估磁珠的回收能力。通?？赏ü扑愕贸觯夯厥招?（纯化后的DNA质量/Input DNA质量）×100%。如下图数据所示：翊圣DNA磁珠批次间稳定性佳，回收效率与XP磁珠相当，可作为一款高性价比产品替换XP磁珠。
表1. 磁珠回收效率计算
平行 | 样本 | Input（ng） | 纯化（1.8×） | ||
纯化后（ng） | 回收率% | 平均回收率 | |||
平行1 | A-XP | 169.5 | 153.25 | 90.41% | 90.41% |
B-YS | 159.75 | 94.25% | 94.5% | ||
C-YS | 162 | 95.58% | |||
D-YS | 158.75 | 93.66% | |||
平行2 | A-XP | 156 | 92.04% | 92.04% | |
B-YS | 156.5 | 92.33% | 93.51% | ||
C-YS | 160 | 94.4% | |||
D-YS | 159 | 93.81% | |||
【注】：磁珠测试数据来源于上海某生物公司，表格中A为AMPure XP磁珠；B、C、D分别是翊圣磁珠三个不同批次。
3. DNA双轮分?。ㄆ福?/span>
由于二代测序段短读长的局限性，所以终的NGS文库需满足一定的长度要求。片筛的目的在于从片段化DNA中选择特定区域的DNA段，以满足上机需求。比如将样本中的片段分布比作下图中的正态分布，由于磁珠优先吸附大片段，所以第—轮磁珠吸附目的片段以上的大片段，此时弃磁珠留上清（目的片段在上清中）。第二轮磁珠吸附目的片段，此时弃上清，再将磁珠上的目的片段洗脱回收。
图5. DNA双轮分选流程示意图
分选精度则是评估不同的磁珠投入比例分选得到的片段大小。一般以Agilent 2100仪器检测。
在特定磁珠比例条件下，不同样本分选后片段分布范围集中在同一位置。较好的分选效果应该是顶部窄而圆润的独峰。此外不同厂家由于buffer的不同在特定磁珠比例条件下分布也会有一定的差异，使用前需根据各厂家相应的说明书确认目标片段的分选比例。如下数据所示：相同的分选比例，翊圣磁珠与进口XP磁珠，分选效果高度一致。
表2. 分选效率计算
样本 | 测试人 | 分选（0.65×/0.2×） | 测试人 | 分?。?.65×/0.2×） | ||||||
Input（ng） | 分选后（ng） | 回收效率% | 平均回收率 | Input（ng） | 分选后（ng） | 回收效率% | 平均回收率 | |||
A-XP | 测试人1 | 276.44 | 55.2 | 19.97% | 19.97% | 测试人2 | 276.44 | 48.9 | 17.69% | 17.69% |
B-YS | ||||||||||
61.35 | 22.19% | 22.84% | 60.15 | 21.76% | 21.31% | |||||
C-YS | 65.4 | 23.68% | 60.15 | 21.76% | ||||||
D-YS | 62.55 | 22.63% | 56.4 | 20.4% | ||||||
【注】：磁珠测试数据来源于上海某生物公司，表格中A为AMPure XP磁珠；B、C、D分别是翊圣磁珠三个不同批次。
三、产品信息
Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，配合精心优化过的缓冲体系，可用于二代测序文库构建过程中的DNA段分选、纯化。本产品可适用于各品牌的DNA、RNA建库试剂盒，和目前广泛使用的XP 磁珠使用方式相同，片段回收效率和文库大小分布均与 XP 磁珠高度吻合。但翊圣磁珠的可以做到3元/库，与进口XP磁珠达到3倍之差！
表3. 2020翊圣磁珠价格
翊圣磁珠 | 规格 | 价格/元 |
Hieff NGS® DNA selection Beads | 450ml/瓶 | 26186 |
*/元（即日至4月30日） | ||
1~5瓶，13500/瓶 | ||
6~10瓶，12000/瓶 | ||
11~20瓶，9800/瓶 | ||
21~50瓶，8000/瓶 | ||
51~100瓶，7000/瓶 | ||
>100瓶，另议 | ||
