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从武汉肺炎爆发以来，翊圣生物积极参与其中，基于长期储备的分子酶双向改造、蛋白发酵纯化和高效抗体筛选技术平台，翊圣生物已储备有2000多万份新型冠状病毒检测试剂盒酶原料，可日组装40万次新型冠状病毒核酸检测试剂盒！现在我们总结武汉肺炎诊断试剂盒（RT-PCR法）中的核心原料的开发策略，供读者参阅。
一、开发目的：
利用中国CDC和WHO指导文件中相关基因的引物和探针，依次验证质粒标准品、假病毒标准品，筛选出适合新冠病毒的RNA扩增试剂。
二、开发策略：
1. 模拟测试质粒标准品样本
将检测灵敏度和特异性作为RT-PCR探针法检测试剂的核心指标，筛选出了灵敏度至少达到10 copies (20 μL反应体系)，高特异性判别新冠病毒ORF1ab、N gene和E gene的候选配方。
图1. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene质粒为模板，模板投入量107-101拷贝数，采用CDC建议引物和探针，进行单管多重扩增检测。在此过程中，根据引物和探针属性，优化扩增程序
图2. 以SARS-CoV-2 ORF1ab质粒，E gene PCR产物为模板，模板投入量107-101拷贝数，采用WHO建议引物和探针，进行单管多重扩增检测。在此过程中，根据引物和探针属性，优化扩增程序。
2. 模拟测试假病毒标准品样本
模拟新冠病毒样本核酸提取到扩增全流程，筛选出了假病毒样本灵敏度至少达到103 copies/mL (25 μL反应体系)的配方。
图3. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量107-103 copies/mL，采用中国CDC建议引物和探针，进行单管多重扩增检测。
3. 试剂稳定性测试
将试剂保存条件的容忍度和批次稳定性作为试剂稳定性的评估指标，测定该配方批次间和批次内CV值＜5%，可反复冻融次数50次，4℃，25℃保存一周，性能无变化，保证了质量稳定可靠。
图4. 生产批次：H1029950。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量107-103 copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较Ct值和扩增曲线线型。
图5. 生产批次：H1029950、H1029920、H1025890。以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量107-103 copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较Ct值和扩增曲线线型。
图6. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量106-103 copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较4℃、25℃保存1-7天后Ct值和扩增曲线线型。
图7. 以SARS-CoV-2 ORF1ab和N gene假病毒为模板，模板投入量106-103 copies/mL，进行单管多重扩增检测，比较反复冻融50次处理后Ct值和扩增曲线线型。
三、RT-PCR检测试剂盒：Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit
至此，即开发出基于多重荧光RT-PCR原理，可以以冠状病毒RNA为模板进行多重定量PCR反应的定量试剂，并作为新型冠状病毒核酸检测试剂盒的核心组分，用于试剂盒组装。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES60 | 100 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES80 | 1000 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit | 13110ES92 | 10000 T |
搭配UDGase/dUTP，可预防气溶胶污染，产品如下：
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES60 | 100 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES80 | 1000 T |
| Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus) | 13111ES92 | 10000 T |
HB200225
