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酶法試劑盒操作步驟
閱讀：869 發(fā)布時間：2020-12-18一、實驗原理
酶法試劑盒（ELISA）實驗原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
二、操作步驟
1.ELISA在操作前試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。按前面試劑準備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
2.設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
3.溫育好后揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。如此重復4次（共洗板5次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。
ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
5.檢測完成后，以標準品濃度做為縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的終濃度。
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