亚洲精品综合日韩中文字幕网站_精品综合久久久久97_中文在线天堂网www_久久精品免费一区二区三区_91久久国产综合精品女同国语_久久资源总站在线国产成人

上海北诺生物科技有限公司

中级会员·14年

联系电话

15800960770

您现在的位置: 首页> 公司动态> DNA实验技术:分子克隆的常用载体

DNA实验技术:分子克隆的常用载体

2013-10-12  阅读(4789)

分享:
DNA段的克隆需要合适的载体,载体或是质粒,或是噬菌体,或是病毒,通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件:一是该载体在细胞内必须能自主复制,即必须具备复制原点;二是该载体必须具备适合的酶切位点,且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条,保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆,载体上常有筛选标记,如对抗菌素的抗性,某些基因产物的显色反应等。
 
一、质粒
常用的有pBR322,pUC系列质粒等。

(一)pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体,有2个抗药性基因(四环素和氨苄青霉素),一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时,它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆 之用。

(二)pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒,有一个复制起点,一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点,多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株(M15)时,因为由质粒表达的α-肽补充了大肠杆菌却失的α-肽,所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上,长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA,由于它破坏了α-肽的表达,因而在加入IPTG和X-gal的培养基,不能长出蓝色克隆,这就是所谓的蓝白筛选。

二、单链丝状噬菌体和噬粒

(一)大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等,其基因组 均是单链闭环DNA分子,其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造,插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体,所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的,M13感染大肠杆菌后,即在菌体内酶的作用下,以感染性单链DNA(正链)为模板,转变为双链DNA,称作复制型DNA(RF DNA)。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时,即停止复制,产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长,并不发生裂解,但生长速度则较正常菌慢,取感染M13的细菌培养液离心,即可从菌体中提取RF DNA,供限制酶切割等分子克隆操作之用;从离心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌体颗粒,提取单链DNA(ss DNA)供DNA序列分析,体外定位突变等使用。

(二)噬粒(phagemid)在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA,即构成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一种噬粒。噬??上褚话阒柿R谎僮鳎毙枰票傅チ碊NA时,就需要在培养时加入辅助噬菌体,常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后,上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外,还有 噬菌体和粘粒,详细情况可参阅有关资料。

会员登录

×

请输入账号

请输入密码

=

请输验证码

收藏该商铺

X
该信息已收藏!
标签:
保存成功

(空格分隔,最多3个,单个标签最多10个字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我们将在第一时间回复您~
产品对比 二维码 在线交流

扫一扫访问手机商铺

对比框

在线留言
临湘市| 平江县| 延安市| 泰来县| 宁城县| 佛教| 广河县| 子洲县| 贡山| 城步| 北碚区| 泗水县| 东乡县| 来安县| 卢湾区| 桐城市| 淮阳县| 宝坻区| 秦安县| 蒙山县| 固镇县| 勃利县| 开封县| 兴化市| 楚雄市| 兴国县| 松桃| 晋中市| 兴宁市| 乌兰察布市| 蓝田县| 兴安盟| 茂名市| 浙江省| 滨州市| 北碚区| 汉川市| 朝阳县| 新郑市| 尉犁县| 东方市|