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胚胎干細胞培養(yǎng)操作規(guī)程
閱讀：136 發(fā)布時間：2015-11-23維持ES細胞處于未分化狀態(tài)：
ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。elisa試劑盒
培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文)。分裝在50ml FALCON管中，(稀釋為2×，每管42ml)，貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液：DMEM(高糖)、馬血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巰基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。
復(fù)蘇細胞：細胞被凍存在10％二甲基亞砜(DMSO)中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復(fù)蘇是很重要的。
操作步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解)；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管)；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。
凍存細胞elisa試劑盒
凍存液：90％HS和10％二甲基亞砜
步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刮刀收集細胞；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。)
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃，第二天移入液氮。
明膠包被：準備500ml 0.1％明膠溶液
1．將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中(50－65℃水浴15～30分鐘)。
2．在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面(15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。)；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。elisa試劑盒