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AP融合蛋白的測定
 
A．酶裂解測定法
 
1．在離心管中加入恒定濃度(1—5ug)的AP融合蛋白以及相應(yīng)的能夠結(jié)合此融合蛋白的抗親和性結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽樹脂。室溫反應(yīng)2小時，溫和搖動。
2．5000g離心1分鐘，棄去上清。用1mlTE重懸并再次離心。以TE和蛋白酶反應(yīng)緩沖液分別洗滌樹脂一次。
3．以200ul蛋白酶反應(yīng)緩沖液重懸此洗滌過的樹脂。為達(dá)到一個適合的反應(yīng)速率所需的蛋白酶的量需要通過預(yù)實驗進(jìn)行測定。對于一個預(yù)實驗，陽性對照和陰性對照的底物融合蛋白應(yīng)該用一系列濃度的蛋白酶進(jìn)行處理。
4．在不同的時間間隔，從反應(yīng)體系上清中吸取20ul溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管或微孔板中。合理地設(shè)置時間間隔，使之能夠監(jiān)測廣泛變化的反應(yīng)速率。例如，在反應(yīng)的*分鐘間隔2分鐘取樣，之后的20分鐘內(nèi)間隔5分鐘取樣，然后在接下來的60分鐘內(nèi)間隔15分鐘取樣。
5．將10ul AP樣品和90ul的AP底物溶液(根據(jù)商說明書制備)加入到一個單獨的微孔板中。繪制純化AP已知濃度的一個標(biāo)準(zhǔn)曲線。以合適的波長對反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測，通常使用能夠讀取動力學(xué)數(shù)據(jù)的酶標(biāo)儀。
6．測定反應(yīng)的起始速率，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計算出樣品中釋放的AP濃度。繪制出隨時間變化而被酶切釋放出的AP。如果底物濃度比K，值小得多，那么起始反應(yīng)速率與底物連接序列酶切反應(yīng)的是kcat/Km值是成比例的。
 
B．底物連接序列的蛋白酶酶切位點的測定
 
1．進(jìn)行類似實驗方案7，2B中提供的酶切反應(yīng)，在一個較小的體積中(50ul)，使用更多  的AP融合蛋白(5～10ug)并捕獲更多的樹脂。加入足夠的蛋白酶，反應(yīng)足夠長的時  間以消化底物連接序列，以酶切動力學(xué)數(shù)據(jù)作為參照。
2．SDS—PAGE以分離反應(yīng)混合物。對于某些蛋白酶，建議在上樣之前使用適合的試劑使  酶失活，  因為像類似枯草桿菌蛋白酶的酶類能夠在變性和加熱的過程中以非特異的方  式消化蛋白。
3．將蛋白從凝膠上電轉(zhuǎn)化至膜上，染色顯示切割后的AP產(chǎn)物，并用標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行  NH2端測序。