聯(lián)系電話
上海寶葉生物科技有限公司
中級會員·6年
- 聯(lián)系人：
- 蔣先生
- 電話：
- 手機(jī)：
- 13391038817
- 地址：
- 上海市嘉定區(qū)新源路155弄
- 個性化：
- www.shjsbio.com
- 網(wǎng)址：
- www.shjsbio.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
1 噬菌體展示技術(shù)合適嗎?
借助在噬菌體展示技術(shù)中使用的絲狀噬菌體，我們關(guān)心的DNA結(jié)合區(qū)域通常與較小的pⅢ衣殼蛋白融合后進(jìn)行表達(dá)，通過細(xì)菌的細(xì)胞膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移，然后被組裝到包裹病毒基因組的噬菌粒顆粒的頭部。zui初的多肽結(jié)構(gòu)域的噬菌體展示實(shí)驗(yàn)，是用諸如抗體、激素或胞外酶之類的分泌性蛋白質(zhì)來進(jìn)行的，它們本來就可以穿過生物膜并能在氧化性環(huán)境中保持穩(wěn)定；但我們現(xiàn)在知道，很多諸如DNA結(jié)合區(qū)域之類的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，也可以成功地展示在噬菌體表面。即使是這樣，蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的跨膜轉(zhuǎn)移偶爾仍然會阻礙某些多肽（特別是那些帶有較高電荷的多肽）的噬菌體展示。核酸結(jié)合區(qū)域常常帶正電荷，從而與凈帶負(fù)電荷的磷酸二酯鍵形成的骨架相互作用。而我們先前注意到：有些高度堿性的結(jié)構(gòu)域，如BIVTat的zui小的結(jié)構(gòu)域，就不能被展示到噬菌體表面。
另外，在著手于噬菌體展示之前至少還應(yīng)該考慮兩個其他因素。首先，雖然能被展示的結(jié)構(gòu)域的大小似乎一般沒有限制（見第1章），但這個技術(shù)可能于研究較小的基序（10 kDa上下），自然界中有很多這樣的基序。其次，還有一個更嚴(yán)格的限制，那就是絕大多數(shù)的天然基序都進(jìn)化成以非共價(jià)結(jié)合的二聚體的形式，與回文結(jié)構(gòu)的或近似對稱的DNA字列相結(jié)合。雖然用噬菌體展示技術(shù)來篩選這樣的基序也是可能的，但其他技術(shù)，如細(xì)菌的“單雜交”（one-hybrid）方法，可能更適合于這個任務(wù)。
2 了解蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合模式了嗎?
從鋅指結(jié)構(gòu)的噬菌體展示中得到的zui重要的經(jīng)驗(yàn)之一，就是預(yù)先了解蛋白質(zhì)與DNA相互作用的模式可能是非常重要的。一個高分辨率的蛋白質(zhì)—DNA結(jié)構(gòu)顯示了與DNA結(jié)合的模式以引起分子間識別的接觸方式，這無疑為這個問題提供了zui大的幫助。一個明顯的需要考慮的因素就是所關(guān)心的基序是以單體的形式還是以二聚體的形式與DNA結(jié)合的。鋅指結(jié)構(gòu)尤其適合于噬菌體展示，因?yàn)樗鼈兪且怨矁r(jià)連接的串聯(lián)體（concatamer）的形式與DNA結(jié)合的，允許對不對稱DNA序列的識別。
另一個需要考慮的因素，是復(fù)合體（complex）中的DNA是否以任何方式變形。一個嚴(yán)重變形的復(fù)合體不意味著噬菌體展示的實(shí)驗(yàn)是不可能的，而可能是預(yù)示篩選只可能針對一個有限的DNA序列的子集進(jìn)行的，或者是預(yù)示得到的DNA結(jié)合區(qū)域可能是非特異性結(jié)合的。從極少量的DNA序列能形成結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)這個意義上來說，誘導(dǎo)后的蛋白質(zhì)與DNA恰當(dāng)?shù)南嗷プ饔檬歉叨葘ｉT化的。因此在這些情況中，分子間的識別常常高度依賴于與不直接包含序列信息的DNA骨架的接觸。從Zif268和與其相關(guān)的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)中可以看到，鋅指結(jié)構(gòu)在幾何結(jié)構(gòu)上適合于結(jié)合DNA，不會對雙螺旋結(jié)構(gòu)造成任何較大的混亂。
3 應(yīng)該隨機(jī)突變蛋白質(zhì)的哪一個結(jié)構(gòu)域?
http://www.shjsbio.com/
