ALSTEM是一家位于湾区的早期生物技术公司，拥有快速扩展的产品和服务组合，为生物制药和学术机构提供服务。受到加利福尼亚干细胞研究承诺的启发，ALSTEM于2012年由具有iPS细胞重编程和基因组编辑技术专业知识的科学家创立。

ALSTEM VP200说明书

Retroviral Packaging Mix: #VP200

逆转录病毒包装混合物：＃VP200

描述

逆转录病毒包装混合物提供了一种快速方便的方法，用于产生高滴度的无复制能力的逆转录病毒。这种基于Moloney鼠白血病病毒（MMLV）的包装系统拥有您的靶细胞所需的理想宿主范围。它是一种即用型逆转录病毒包装混合物，含有VSVG，仅需48小时即可产生高滴度的逆转录病毒。这些必需的病毒结构基因的单独表达通过小化细胞分裂过程中产生的风险并降低产生具有复制能力的病毒的机会来确保对重组构建体的安全性和控制。

• 概观

逆转录病毒包装混合物是用于产生高滴度泛热反转录病毒的优化配方。

• 通过瞬时转染实现10 ^7个感染单位/ ml的平均滴度
• 简单共转染逆转录病毒包装混合物和含有您感兴趣的基因的表达载体
• 产生自我失活的泛热反转录病毒

第1天：

1.在10cm培养皿中培养293T细胞（每10cm培养皿约4×10 ^6个细胞）。

第2天：

2.检查以确保细胞达到70-80％汇合。

3.对于每个10cm培养皿，准备转染复合物如下：

一个。1.5ml试管A：在0.5ml无血清培养基（例如DMEM）中稀释7.5μgDNA质粒和15μl逆转录病毒包装混合物。通过移液混合。

湾 1.5ml离心管中B：稀释NanoFect的45μL ^TM转染试剂在0.5ml无血清培养基中并轻轻混合。

C。将NanoFect / DMEM添加到DNA / DMEM溶液中。通过涡旋混合5-10秒，然后在室温下孵育DMEM-质粒-NanoFect混合物15分钟。

4.将来自步骤3的完整转染复合物逐滴添加至细胞，并旋转培养皿以将转染复合物均匀地分散在平板中。

5.将板在37°C孵育过夜。

第3天：

6.用10ml新鲜培养基更换上清液。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X，ALSTEM，目录号VB100）补充培养基，以提高病毒滴度。

7.在37°C孵育24小时。

第4天（1 ^ST收获）：

8.将含有逆转录病毒的上清液收集到50ml无菌带盖的锥形离心管中。

9.在4℃下以3000rpm离心上清液15分钟以沉淀细胞碎片。

10.通过低蛋白结合0.45-μm无菌过滤器过滤澄清的上清液。

11.病毒已准备好进行感染，纯化，或者可以在-80°C下作为病毒原液储存，以备将来使用。等分体积优选用于储存以降低冻融循环中的病毒滴度损失。

12.如果需要第二次收获，在次收获后向细胞中加入10ml*培养基，并将培养皿放回37℃培养箱中。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X，ALSTEM，目录号VB100）补充培养基，以提高病毒滴度。

第5天（^第二次收获）

13.第二次收获可在第5天完成，步骤8-11之后。

14.为了浓缩病毒，将1体积的逆转录病毒浓缩溶液（ALSTEM，cat.no.VC200）加入到4体积的病毒上清液中，并充分混合。

15.将混合物置于4°C冰箱中过夜，第二天将病毒沉淀。有关详细信息，请参阅用户手册。

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