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pcr擴(kuò)增的工作原理
PCR實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)中常見(jiàn)用的實(shí)驗(yàn)之一，在基因擴(kuò)增、核酸檢測(cè)、基因檢測(cè)等方面廣泛應(yīng)用。pcr擴(kuò)增的原理和步驟如下：
一、試劑準(zhǔn)備：
PCR常用的試劑主要包括 DNA 模板、引物、ddH 2 O、 DNA 聚合酶以及特定的反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgSO 4（可選）和 DMSO （可選）。
二、PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA 或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿?
1.DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq 聚合酶。如果您想對(duì)沒(méi)有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR，請(qǐng)選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測(cè)特定序列的存在，就選擇普通的 Taq 聚合酶。如果要對(duì)T-vector連接的片段進(jìn)行PCR，要注意 ，因?yàn)榇蠖鄶?shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒(méi)有 A-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR 實(shí)驗(yàn)后添加 A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則：
①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來(lái)說(shuō)是足夠長(zhǎng)的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì)，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。