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PCR中各種熱啟動(dòng)酶存在的意義

時(shí)間:2023/6/9閱讀:650
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各種熱啟動(dòng)酶存在的意義

市場上熱啟動(dòng)的酶種類很多,但新手并不了解熱啟動(dòng)酶存在的意義。
非熱啟動(dòng)的Taq酶在較低溫度時(shí)也有活性:我有一本1992年出版的《PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)》中提到,酶在70度時(shí)的合成速度為60核苷/秒/酶分子,55度時(shí)為22,37度時(shí)為1.5,22度時(shí)為0.25。也就是說此時(shí)引物還沒有正常配對(duì)(其可能錯(cuò)誤配對(duì)),而酶已經(jīng)開始合成了,其合成的產(chǎn)物就會(huì)成為以后擴(kuò)增中的非特異模板。

則熱啟動(dòng)酶只有在95度高溫一段時(shí)間后,其酶活動(dòng)才啟動(dòng)起來,故名:熱啟動(dòng)酶。

這也是為什么進(jìn)行PCR反應(yīng)加樣時(shí),各種試劑要在低溫下加樣。但是不是在進(jìn)行PCR反應(yīng)加樣時(shí)維持低溫就不需要熱啟動(dòng)酶了呢?答案是也不盡然。

一般PCR儀在運(yùn)行開始后熱蓋加熱過程中,模板溫度是不控制的。由于熱蓋的加熱需要1.5分鐘以上,且熱蓋溫度一般設(shè)在105度,必然會(huì)引起模塊溫度的上升,一般會(huì)到30-35度,環(huán)境溫度高時(shí)更甚。也就是說設(shè)計(jì)不完備的儀器也會(huì)提高非特異性反應(yīng)。

有些儀器的熱蓋在開機(jī)時(shí)就啟動(dòng),這樣做有可以廣場燙手且用戶開機(jī)后立即啟動(dòng)PCR程序也會(huì)造成非特異性反應(yīng)。東勝龍811PCR儀的解決辦法是在運(yùn)行開始后熱蓋加熱過程中迅速將模塊降溫到10度左右。熱蓋溫度到達(dá)后啟動(dòng)程序運(yùn)行。

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