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上海巴玖為您講解PCR實驗的準(zhǔn)備工作及步驟

時間:2021/1/11閱讀:1638
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步驟構(gòu)成:

①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;
③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在酶的作用下,以P為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
  重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
 
實驗試劑與器材:

模板DNA、2.5mmol/L   q DNA聚合酶(5U/SSR引物
10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
PCR儀、移液槍、PCR板

實驗步驟:
  
一、實驗器具與材料:
  1、移液槍:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
  2、吸頭:1ml、200μl、20μl
  3、勻漿管:5ml
  4、吸頭臺:放置1ml吸頭的一個,放置20μl吸頭的一個
  5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
  6、試劑瓶:2個60ml的棕色試劑瓶(廣口,帶蓋)
  1個125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇)
  7、量筒:50ml、250ml、500ml
  8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
  9、試管架:5ml、1.5ml、20μl
  10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個備用,一個裝無水乙醇,另一個裝DEPC水
  11、鋁制飯盒:4個
  12、塑料小飯盒:1個
  13、大瓷缸:2個
  14、錫泊紙:一卷
  15、卷紙:2卷
  16、三角燒瓶:帶蓋,稍大

實驗器具的處理與準(zhǔn)備:
  
1、塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等)
  先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個浸泡其中,其中小槍頭需要吸管打入DEPC水,過夜,然后高壓,再烤干備用,實驗前將槍頭等放入吸頭臺,再高壓一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜,再烤干)
3、勻漿器:(包括剪刀、鑷子)先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC)

試劑配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇:用無水乙醇 DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)
3、異丙醇:放入棕色瓶中
4:放入棕色瓶中
5、瓊脂糖

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