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瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞

閱讀:2778          發(fā)布時(shí)間:2012-10-10

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞

目的

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞是一種方便的方式過度兩個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞外分泌或膜蛋白。293是人類上皮細(xì)胞,腺病毒轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)品。293 T是導(dǎo)數(shù)表達(dá)SV4 0大T抗原,使游離復(fù)制質(zhì)粒含有SV4 0的起源和早期啟動(dòng)子區(qū)域。他們兩個(gè))不尋常的財(cái)產(chǎn)被高度transfectable由以下磷酸鈣(磷酸)2transfection協(xié)議。高達(dá)50%的效率是可以實(shí)現(xiàn)的

材料

*培養(yǎng)(高血糖補(bǔ)充瓦特/ 10%總線(無論是瓦特/瓦特/滅活在55°/分鐘),非必需氨基酸,na-pyruvate,和谷氨酰胺筆/ streptmycin可選)

轉(zhuǎn)染試劑

200 CaCl 22米,過濾消毒儲(chǔ)存在4攝氏°

二)x2hbs8.0克氯化鈉,氯化鉀0.37g,201mg是的毫克)2HPO 4無水,葡萄糖5克/毫升培養(yǎng)基(調(diào)整PH值7.05氫氧化鈉和過濾消毒,儲(chǔ)存在4攝氏°

脫氧核糖核酸試劑盒提取成績(jī)溶液中電子兼容。基本上,沒有必要脫氧核糖核酸。

程序

培養(yǎng)條件

增長(zhǎng)將很快通常倍增時(shí)間< 1天的觀察。分裂細(xì)胞4天,每3 ~ 10至1 : 20稀釋和文化下5%的二氧化碳。細(xì)胞松散連接所以你可以分離細(xì)胞與ED TA單獨(dú)但短暫的胰蛋白酶消化單懸。overtreat胰蛋白酶

轉(zhuǎn)染293細(xì)胞

以下的協(xié)議是10厘米的菜(中10毫升)。如果你使用6孔12孔板總體積的介質(zhì)應(yīng)3毫升一點(diǎn)五毫升,分別和數(shù)額減少每個(gè)試劑因此。

1。細(xì)胞的前一天晚上60 - 70 %融合在一天的轉(zhuǎn)染。如果達(dá)到100%效率也會(huì)降低總匯小于50%融合可能確定但數(shù)額蛋白表達(dá)會(huì)很低,因?yàn)樯倭?/span>的細(xì)胞

2。一小時(shí)前的轉(zhuǎn)染,改中含有25µ氯喹(從中國(guó)股票在公共電視網(wǎng),儲(chǔ)存在- 20攝氏°。量應(yīng)該是10毫升每。(氯喹可以省略,效率提高10

3。添加10µ基因ddh2o(1095µ總)15毫升無菌試管,然后添加155µ200氯化鈣。當(dāng)你準(zhǔn)備好后,加入1250µ2xhbs輕輕攪拌。添加此混合物直接向細(xì)胞通過介質(zhì)做在1 - 2分鐘后加入2xhbs。你會(huì)發(fā)現(xiàn)變成橙色。確保你均勻?yàn)?/span>在整個(gè)地區(qū)

4。培養(yǎng)7 - 11小時(shí)很細(xì)可見粉塵狀沉淀。孵化后,沖洗一次,變化氯喹,10 ml /。

5。收獲細(xì)胞,或培養(yǎng)上清液中,轉(zhuǎn)染后48至72小時(shí)。分泌蛋白,可以改變你的媒體(3天或4節(jié)省收集增刊)并給它一個(gè)3 - 4天的文化。只要細(xì)胞還活著他們生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。然而,當(dāng)時(shí)的分泌水平達(dá)到zui大值之間的差異蛋白質(zhì)

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