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恒远文献：丹参注射液预防大鼠急性胰腺炎及其机制研究
阅读：425 发布时间：2019-12-20丹参注射液预防大鼠急性胰腺炎及其机制研究
?？∪?br />内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050
摘 要：目的 观察丹参注射液预防大鼠急性胰腺炎及其对血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-6）、胰腺组织核因子（NF-κB）及氧自由基的影响。方法 将 60 只 SD 大鼠随机分为 6 组，分别为假手术组、模型组、乌司他丁组（20 000U/kg）以及丹参注射液低、中、高剂量（0.4、0.8、1.6 mL/kg）组。用 5%?；堑ㄋ崮疲?.0 mL/kg）胰管内注入诱导大鼠急性胰腺炎模型，造模前 30 min 分别尾 iv 给予丹参注射液。各组大鼠均于造模 6 h 后行腹主动脉采血，处死大鼠取胰腺组织标本，检测 SD 大鼠急性胰腺炎模型血清淀粉酶（AMY）、血浆内毒素（ET）、胰腺病理评分和病死率。并用 ELISA 法检测血清 IL-6、TNF-α 浓度的变化，运用免疫组化法检测 NF-κ B 表达水平，同时切取各时间点大鼠胰腺组织，检测丙二醛（MDA）、组织髓过氧化物酶（MPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的水平。结果 模型组大鼠的血清 AMY、血浆 ET、病理评分、死亡率、IL-6、TNF-α 水平及胰腺组织中 NF-κB 活性、MDA 水平和 MPO 活性均较假手术组升高（P＜0.01），而 SOD 活性则明显降低（P＜0.05）；乌司他丁组和丹参注射液组上述各项指标均较模型组明显改善（P＜0.05、0.01）。结论 丹参注射液可显著降低实验性急性胰腺炎大鼠的 IL-6、TNF-α 及 NF-κB，清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应，从而减轻急性胰腺炎病理损害程度，降低急性胰腺炎大鼠的死亡率。
关键词：丹参注射液；急性胰腺炎；大鼠；IL-6；TNF-α；NF-κB；氧化应激
急性胰腺炎是胰腺的急性炎症，轻症急性胰腺炎为自限性，无明显的器官功能障碍；重症急性胰腺炎则有胰腺坏死、出血，炎症可波及胰周组织，甚至累及远处器官．可出现局部并发症，如胰腺坏死、胰腺假性囊肿、胰腺脓肿等，亦可并发多器官功能衰竭，死亡率 10%～20%[1]。丹参注射液的主要组分为丹参，具有活血化瘀的功能，主治瘀血闭阻所致的胸痹，症见胸部疼痛、病处固定，或冠心病、心绞痛见上述证候者[2-3]。研究表明，丹参注射液能够显著降低急性胰腺炎患者的血黏度，改善胰腺的微循环障碍，减轻胰腺病变，被推荐为临床上治疗急性胰腺炎的常用辅助治疗药物，能够有效降低病死率，减少并发症[4]。本实验考察丹参注射液对急性胰腺炎大鼠血清淀粉酶、血浆内毒素、胰腺病理评分和病死率的影响，判断丹参注射液是否具有改善胰腺病理损害的治疗作用。同时测定血清IL-6、TNF-α、NF-κB 活性及氧自由基，探讨丹注射液对急性胰腺炎的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物和分组
清洁级雄性 SD 大鼠 50 只，体质量（280±20）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号
SCXK（沪）2007-0005。SD 大鼠随机分为 6 组，每组 10 只，分别为假手术组、模型组、乌司他丁组（20 000 U/kg）以及丹参注射液低、中、高剂量（0.4、0.8、1.6mL/kg）组。在 22 ℃恒温房内饲养，标准颗?；旌纤橇衔顾恰?br />1.2 药物与试剂
?；堑ㄋ崮疲拦?Sigma 公司，批号 TO875，质量分数≥95%）；丹参注射液（上海第yi生化药业
有限公司，批号 1007291，规格 2 mL/支）；IL-6、TNF-α 试剂盒（北京方程生物科技有限公司）；ET-1试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）；淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、组织髓过氧化物酶（MPO）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；NF-κB鼠单克隆抗（Santa Cruz公司）；注射用乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司，批号 20120119，规格 100 000 U/支）。
1.3 方法
1.3.1 急性胰腺炎动物模型的建立 参照 Aho[5]的方法。SD 大鼠术前禁食 12 h 以上，不禁水，采用ip 10%水合氯醛溶液麻醉，剂量为 4.0 mL/kg，大鼠取仰卧位，四肢及头部无创固定于手术台上，去毛
备皮，消毒，铺无菌巾。正中切口进腹，切口长约2.0 cm，沿幽门寻及十二指肠，定位胰胆管十二指
肠开口，于胰胆管开口附近十二指肠壁上用 4 号头皮静脉针穿刺进入肠腔内，再穿入胰胆管内，用胆
管脉夹夹闭胆胰管近肝门端，缓慢注入 5%?；堑ㄋ崮疲?.0 mL/kg），保持压力 5 min 后拔去胆管、
退出穿刺针，缝合十二指肠，逐层关腹。
1.3.2 给药 丹参注射液组在造模前 30 min 分别尾 iv 给予丹参注射液 0.4、0.8、1.6 mL/kg，模型组在造模前尾 iv 给予 1.5 mL/kg 生理盐水，假手术组尾 iv 给予 1.5 mL/kg 生理盐水，进腹后不插管，仅显露、牵拉胰腺即关腹。乌司他丁组于造模后即刻ip 注射用乌司他丁 20 000 U/kg。造模后 6 h 后行主动脉采血，处死大鼠，并剖腹快速取胰腺组织标本，待测。
1.3.3 标本采集 各组大鼠均于造模 6 h 后行腹主动脉采血 2 mL，所采血标本 37 ℃静置 20 min，随
即 4 ℃、3 000 r/min 离心 15 min，分离血清，移取血清于 EP 管中，置于−20 ℃冰箱中冻存备用（用于血清 IL-6、TNF-α 测定）。取血 2 mL，迅速注入冷却的酶抑制剂（10%EDTA·Na2 30 μL 和抑肽酶 40 μL）抗凝管中，摇匀，4 ℃、3 000 r/min 离心 10 min，分离血浆，−20 ℃保存待测（用于血浆 ET-l 测定）。处死大鼠后迅速剖腹分离胰腺，将其中一部分迅速保存于液氮罐中，然后转移至−80 ℃冰箱中冻存，用于组织匀浆（用于胰腺组织 SOD、MDA 及MPO 测定）。将另外一部分胰腺组织用 10%福尔马林固定，用于病理组织学分析。
1.3.4 组织病理学观察 处死大鼠后迅速摘取每大鼠胰腺，取部分胰腺组织常规制成石蜡切片，HE染色，由病理科医生对大鼠胰腺组织切片，在光学显微镜下观察胰腺组织病理变化，并按照 Schmidt法半定量评分标准进行组织病理学评分[6]。
1.3.5 指标检测 采用酶法，由贝克曼库尔特AU5800 全自动生化分析仪进行检测。采用放射免疫法检测血浆 ET-1，试剂盒可检测范围 20～−1 000pg/mL，灵敏度为 5 pg/mL；采用 Indogen 法行 125IET-1 标记，比放射性为 1 750 Ci/mmol；取采集好的血清标本采用双抗体央心法酶联免疫法吸附试验（ELISA）检测血清 IL-6、TNF-α 含量，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，后于酶标仪 450 nm 处现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 30 卷 第 1 期 2015 年 1 月 ·15·测定各孔吸光度值，重复测 3 次。通过标准曲线计算样品中大鼠血清中 IL-6、TNF-α 浓度；取大鼠胰腺组织石蜡切片，常规脱蜡，梯度水化，然后采用链霉亲合素–过氧化物酶（S-P）法检测胰腺细胞NF-κB 活性；取冻存的胰腺组织用冷生理盐水制备成 10%组织匀浆，超声粉碎后，4 ℃下 10 000 r/min高速离心 15 min，取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD、MDA。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。MPO 活性采用比色法测定，460 nm 波长，1 cm 光径，比色。以上操作均严格按照试剂盒说明书完成。
1.3.6 死亡率观察 实验期间观察各组大鼠死亡情况，计算各组死亡率，进行比较。
1.3.7 统计学方法 采用 SPSS 18.0 统计软件进行数据处理，数据以?x ± s 表示，计量资料采用 t 检验，计数资料采用 χ
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