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恒远文献:大鼠肺纤维化模型中 NLRP3、IL-18 表达及意义的探讨
阅读:460 发布时间:2019-11-22大鼠肺纤维化模型中 NLRP3、IL-18 表达及意义的探讨
孙云晖 王一新 马雪梅 杨晓东 李树民
【摘要】 目的 观察博来霉素致肺纤维化大鼠肺组织中 NLRP3、IL-18 的表达水平,探讨其在肺纤维化发生、发展中的意义。方法 将 45 只清洁级 Wistar 大鼠按随机数字表法分为健康对照组( N 组) 、博来霉素组( B 组) 、地塞米松治疗组( D 组) ,每组大鼠各 15 只,B 组及 D 组大鼠给予气管内注射博来霉素 4mg /kg 制作肺纤维化模型,N 组给予相同体积生理盐水作为对照,D 组大鼠于肺纤维化造?;∩系?2 天每日腹腔注射地塞米松 3mg /kg,N、B 组大鼠腹腔注射生理盐水作为对照。各组大鼠分别于造模后 7、14、28 处死,HE 染色评价肺组织病理形态学变化,碱水解法及酶联免疫吸附法分别测定肺组织匀浆中羟脯氨酸( HYP) 、NLRP3含量,RT-PCR 法测定肺组织中 IL-18mRNA 表达量。结果 ( 1) HE 染色示 B、D 组大鼠第 7 天肺间质和肺泡腔内可见大量炎细胞浸润,此后炎症随时间推移逐渐减轻,逐渐发展为晚期纤维化性变; B、D 组 HYP 含量随时间推移逐渐升高,以 28 天为著,P < 0. 05; ( 2) B、D 组 NLRP3、IL-18mRNA 表达于第 7 天升高至zui高点,后逐渐降低,至 28 天均高于 N 组,差异有统计学意义( P < 0. 05) ; ( 3) D 组 NLRP3、IL-18mRNA 表达在同一时间均低于 B 组,P < 0. 05。结论 NLRP3、IL-18 在大鼠肺纤维化发病早期起重要作用,可能参与了肺纤维化发生与发展。
【关键词】 肺纤维化; NLRP3; IL-18; 博来霉素特发性肺纤维化是间质性肺炎中常见的一种,高发于老年人群,以胸膜下肺基底部分布为主,HRCT 上可表现有数量不等、范围有限的磨玻璃影及网格影[1]。有研究报道肺纤维化是由肺组织受到损伤后,修复调节失控及重建异常引起的病理改变,是一系列细胞因子、炎性因子、生长因子等通过多条信号转导通路共同作用的结果[2]。近年来研究发现,肺组织损伤可导致组织蛋白酶及 ROS 大量释放,诱导炎症小体( NLRP3) 高表达,参与慢性炎症形成[3]。白细胞介素-18( Ilterleukin-18,IL-18) 通过调控多种细胞信号转导通路,促进炎症发生,细胞分化,细胞因子等作用[4]。本实验采用大鼠气管滴注博来霉素制作肺纤维化动物模型,旨在探讨NLRP3 /IL-18 轴在博来霉素致大鼠肺纤维化中的表达及作用机制,可为阐明这类疾病发病机制及为治疗提供新思路。资料与方法
一、实验动物
健康清洁级 Wistar 大鼠 45 只( 雌雄各半) ,6 周龄,体重 180 - 220g,由哈尔滨医科大学实验动物学部提供[许可证号: SCXK( 黑) 2013-001],随机分为健康对照组( N 组) 、博来霉素组( B 组) 和地塞米松治疗组( D 组) ,每组各 15 只大鼠,于佳木斯大学动物中心饲养。
二、实验材料与试剂
注射用盐酸博来霉素 BLM( 海正辉瑞制药有限公司提供) ,HE 染色试剂( 湖北锦源医疗科技有限公司提供) ; Nikon eclipse 50i 显微镜( 北京中仪光科科技发展有限公司提供) ; NLRP3 大鼠 ELISA 试剂
盒( 上海恒远生物科技有限公司提供)
三、模型建立及标本留取
B、D 组以 4mg /kg 剂量博来霉素一次性快速推注至气管内,N 组给予等体积生理盐水。D 组大鼠于肺纤维化造?;∩系?2 日开始每日腹腔注射地塞米松 3mg /kg,N、B 组大鼠腹腔注射生理盐水作为对照。各组大鼠于造模后分别于 7、14、28 天处死,取右上肺组织置于 10% 甲醛溶液中固定、脱水、石蜡包埋、常规切片 HE 染色,观察肺组织结构的病理形态学变化; 从左肺组织上留取 50mg 肺组织,制备组 织 匀 浆,用 于 HYP、IL-37 检 测; 取 右 肺 组 织100mg,放入 Eppendorf 管内,- 80℃ 保存,用于检测IL-18mRNA 表达水平。
四、实验方法
碱水解法测定肺组织 HYP 含量,ELISA 法检测肺组织 NLRP3 表达水平,均严格按照试剂盒说明书
进行操作。
五、RT-PCR 检测肺组织 IL-18mRNA 表达水平提取肺组织总 RNA,反转录为 cDNA。目的基因 IL-18mRNA 上 游 引 物: 5'-GAGGACTGGCTGTGACCCTATC-3',下游引物 5'-CCTGGCACACGTTTCTGAAA-3',扩增片段 151bp: 内参照 β-actin mRNA 上游引物: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3',下游引物 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC -3',扩 增 片 段150bp。PCR 反应条件按照试剂盒说明书进行。
六、统计学方法
采用 SPSS22. 0 软件进行统计分析 实验结果采用 x珋± s 表示,多组均数比较采用单因素方差分析,组间多重比较应用 LSD-t 检验,以 P < 0. 05 为差异有统计学意义
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