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“恒远生物”产品文献：滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征
阅读：612 发布时间：2019-4-24滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢颗粒细胞（ＧＣ）分泌功能和细胞因子基因表达的影响
徐括琴１，尹巧芝２，党丽英１，侯玉华１，杨小风１
１．郑州大学附属郑州中心医院 妇产科（郑州４５００００），２．成都中医药大学妇科教研室（成都６１００７５）
摘 要 目的：研究滋阴补阳方序贯疗法对多囊卵巢综合征（ＰＣＯＳ）大鼠卵巢颗粒细胞（ＧＣ）分泌功能和细胞因子基因表达产生的影响。方法：利用随机数字表法将实验雌性性ＳＤ 大鼠分为３ 组，包括空白对照组、滋阴组以及补阳组；选?。?nbsp;周龄同样大鼠灌胃，调配空白血清与用药血清；对ＰＣＯＳ大鼠 ＧＣ 及黄素化颗粒细胞进行分离培养，并以随机方法分为１０组，比较各组细胞培养液里
面雌二醇（Ｅ２）、类胰岛素增长因子（ＩＧＦ－１）、干细胞因子（ＳＣＦ）以及睾酮（Ｔ）水平，并观察ＳＣＦ ｍＲ－ ＮＡ 表达情况。结果：模型组１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平明显低于对照组（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平明显高于
对照组；滋阴方组２ＳＣＦ 与滋阴方组３ＳＣＦ 水平均明显低于模型组１（Ｐ ＜０．０５），而滋阴方组２Ｅ２
与滋阴方组３Ｅ２水平均明显高于模型组１（Ｐ＜０．０５）；模型组１大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达明显高于对照组，且ＩＧＦ－１灰度值明显小于对照组（Ｐ＜０．０５），滋阴方组２ 与滋阴方组３ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达均显著低于模型组１（Ｐ＜０．０５），滋阴方组３ＩＧＦ－１ 灰度值明显高于模型组１（Ｐ ＜０．０５）；模型组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面Ｔ 水平明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）；补阳方组２与补阳方组３Ｔ水平明显低于模型组（Ｐ＜０．０５），而补阳方组１Ｔ 水平与模型组的比较无显著差异（Ｐ＞０．０５）；对照组、模型组、补阳方组黄素化颗粒细胞里面ＳＣＦ 水平、ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达以及ＩＧＦ－１灰度值比较无显
著差异（Ｐ＞０．０５）。结论：对ＰＣＯＳ采取滋阴补阳方序贯疗法，能提高 ＧＣ 分泌功能，同时可以降低卵泡期ＳＣＦ 基因在体内的表达实现，可为ＰＣＯＳ排卵障碍临床治疗提供依据。
主题词 多囊卵巢综合征／中医药疗法 ＠滋阴补阳方 大鼠 动物，实验
中图分类号：Ｒ７３７．３１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊｉ．ｓｓｎ．１０００－７３６９．２０１７．０７．０８３
多囊卵巢综合征（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｏｖａｒｉａｎｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＣＯＳ）是与各器官、系统正常内分泌紊乱相关的疾病，患者临床表现具 有多样化特点，现今其病理机制缺乏统一结论。有报道指出， 育龄妇女群体 ＰＣＯＳ发病率高达５％ ～１０％ ，并且和７５％ 左右无排卵性不孕患者密切相关［１］。亦有研究显示，部分卵巢局部调节因子的表达和 ＰＣＯＳ 发病存在紧密联系［２］。干细胞因子
（Ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ，ＳＣＦ）属于卵巢局部相对重要的一种生长因子，可对细胞增殖分化产生促进作用。现阶段，与 ＳＣＦ 在 Ｐ－ ＣＯＳ患者卵巢局部产生的促进作用相关研究较多，可是涉及ＳＣＦ 在 ＰＣＯＳ临床发病机制中作用的研究却不多。本文以大鼠实验，探讨滋阴补阳方序贯疗法对 ＰＣＯＳ 大鼠卵巢颗粒细胞
（ＧＣ）分泌功能和ＳＣＦ 基因表达产生的影响，现汇报如下。
材料与方法
１ 动物 选取８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠，每只日龄均为２１ 日，体重为４０～５０ｇ；另选?。担爸淮菩裕樱?nbsp;大鼠，每只６周龄，并且体重为１７０～１８０ｇ，所有大鼠均清洁级饲养，给予自然光照，控制室温不超过２０ ℃ ～２５ ℃范围。
２ 药物与主要试剂 由武汉远城科技发展公司提供脱氢表雄酮（ＤＨＥＡ）；浙江田雨药用油有限公司提供实验注射大豆油；滋阴方组成成分为：紫河车、熟地黄、菟丝子、当归、白芍以 及山茱萸等中药；补阳方组成成分为：yin羊藿、党参、补骨脂、巴 戟天以及川续断等?；旌弦陨现幸?，置于水中浸泡１ｈ 后，采用武火煮沸，然后用文火煮 ２０ ｍｉｎ，将其过滤，并且重复煎 ２
次，后合并滤液，置于５５ ℃ ～６０ ℃水浴条件下浓缩。实验给药量依据人鼠剂量［３］进行换算，其中滋阴方含生药量为 ２．４８ ｇ／ｋｇ，对于补阳方，则含生药量为２．２０ｇ／ｋｇ，并将煎剂冷却后放在４℃ 温度下保存。
由 ＨｙＣｌｏｎｅ公司提供 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培养基、胰蛋白酶，由 ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ 公司提供１０％ 胎牛血清；北京赛百盛生物工程公司提供ＳＣＦ 与 β－ａｃｔｉｎ 引物，上海恒远生物科技有限公司提供
ＥＬＩＳＡ 试 剂 盒；Ｂｉｏ－Ｔｅｋｅ 公 司 提 供 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒，；
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ，ＴａｋａＲａ公司；上海博升生物科技有限公司提供孕马血清促性腺激素（ＰＭＳＧ），并由上海生物化学制药厂提供人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）。
３ 实验方法
３．１ 构建实验 ＰＣＯＳ 大鼠模型：对８４ 只雌性 ＳＤ 大鼠进行编号，将其随机分成模型组（ｎ＝６７）与空白对照组（ｎ＝１７）。 ８４只大鼠全部在２１ｄ 龄断乳，实验开始第１ 天为适应性喂养进行２ｄ后，即在２３ｄ 龄，模型组每天需定时在其颈背部采取
皮下注射方式予以６ ｍｇ／１００ｇ 的 ＤＨＥＡ 以及０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，并对对照组每天在颈背部采取皮下注射方式予以０．２ ｍｌ量的注射用大豆油，均持续应用１ 月。模型组大鼠在注射第２０ｄ需要每天获取其阴道涂片，通过阴道涂片了解到大鼠正在动情间期，没有动情周期变化以及排卵现象；２ 组均在第 ３０ｄ进行眼眶静脉采血，其中模型组大鼠血清激素睾酮水平升高表示造模成功，本实验有７只造模失败必须剔除。
３．２ 分裂并且培养颗粒细胞：在第３１ 天需对每只大鼠采取颈部皮下注射方式予以 ＰＭＳＧ５０ＩＵ，并于４８ｈ 后在模型组里面以随机原则?。常爸淮笫螅痹诳瞻锥哉兆槔锩嫜。保?nbsp;只大鼠，将其处死之后摘取卵巢，有效分离并且培养 ＧＣ。对于模型组与对照组之中剩余大鼠，分别为３０ 只与７ 只，均以颈部皮下注射方式给予 ＨＣＧ２５ＩＵ，并在注射后第６天将其处死，然后摘取卵巢有效分离并且培养卵巢部位黄素化颗粒细胞。处于无菌条件下对所取卵巢进行分离处理，去除附近脂肪组织，放于低倍显微镜下采取２５ 号针头将大鼠卵泡刺破，并且轻拍挤压，确保卵母细胞与其颗粒细胞同时顺利逸出。采用２００ 目钢筛进行过滤，并在离心处理后收集颗粒细胞。选用０．４％ 台盼蓝进行染色计数，如果镜下没有染为蓝色，说明是死细胞［４］?？刂?nbsp;ＧＣ 密度数值为１．０×１０５／ｍｌ，并且接种于底面积２５ｃｍ２培养瓶里面，其中每培养瓶体积为 １ ｍｌ，放 在 ３７℃ 且含 ５％ ＣＯ２ 相应培养箱内部恒温培养。待大部分细胞基本贴壁之后需更换培养液，之后应该每隔４８ｈ进行１次更换。待细胞培养４８ｈ，需以０．１％ 胰酶消化，获得单细胞悬液，采取磷酸缓冲液冲洗２次，并以４％ 多聚甲醛将其固定１０ ｍｉｎ。如果 ＨＥ染色显示细胞形态完整，外观为多角形，同时核呈深蓝色，此外胞浆淡红色伴随许多颗粒，且是 ＧＣ，待其贴壁后备用［５］。
３．３ 调配含药血清：将所选５０ 只６ 周实验大鼠按照随机原则分为补阳组、滋阴组以及空白对照组，采用中药与 ０．９％ ＮａＣｌ溶液灌胃。对于灌胃给药剂量，必须是正常大鼠剂量十倍，保证２ 次／ｄ，间隔时间为１２ｈ，控制灌胃药总体积≤３ ｍｌ，且持续给药３ｄ，注意第３ｄ取血样前严格禁食１２ｈ，同时１ 次给予全天剂量，并于给药１ｈ后进行麻醉处理，再行心脏采血。离心处理血样之后，同组血清混合，然后过滤，置于５６ ℃ 温度下灭活，放在－２０ ℃条件存储［６］。
３．４ 分组与药物干预：对所培养获得的颗粒细胞进行分组，共１０组，且各组样本包括５ 个复孔。具体干预措施为：空白对照组采用原代培养所获得的正常大鼠 ＧＣ；模型组１ 采用模型组大鼠 ＧＣ；滋阴方组１采用含５％ 滋阴方药相应血清*培养液，其中包含 ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ 三抗以及１０％ＦＣＳ；滋阴方组２采用含１０％ 滋阴方药相应血清*培养液进行研究；滋阴方组３采用含２０％ 滋阴方药相应血清*培养液进行研究；补阳方组１采用含５％ 补阳方药相应血清*培养液进行研究； 补阳方组２采用含１０％ 补阳方药相应血清培养液进行研究；补
ＰＣＲ 具体反应程序完成后，利用ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ软件自动获取 ＱＲ 值。以荧光定量 ＲＴ－ＰＣＲ 法［８］测定ＩＧＦ－１ 表达灰度值。
４ 观察指标 观察各组细胞培养液里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ、Ｔ 水平、ＩＧＦ－１表达灰度值及ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达情况。
５ 统计学方法 选用ＳＰＳＳ１９．０ 统计学软件分析观察指
标数据，其中计量资料以珚ｘ±ｓ 表示，计数资料以（％）表示，分别用ｔ 值与 χ２ 值检验。结果显示 Ｐ ＜０．０５ 表明差异有统计学意义。
结 果
１ 对照组、模型组１与滋阴方组 ＧＣ 里面 Ｅ２ 、ＳＣＦ 水平比
较 模型组１ＧＣ 里面 Ｅ２ 水平为（２４．５３±６．０２）ｐｍｏｌ／Ｌ，明显低于对照组（３３．５４±６．０９）ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｐ ＜０．０５），且 ＳＣＦ 水平（２７８６．
００±９４．００）ｐｇ／ｍｌ，明显高于对照组（２５４９．００±５８．００）ｐｇ／ｍＬ；
滋阴方组２ＳＣＦ（２４８９．００±１２７．００）ｐｇ／ｍｌ与滋阴方组 ３ＳＣＦ
（２４７３．００±１０９．００）ｐｇ／ｍＬ 均明显低于模型组１（Ｐ ＜０．０５），而滋阴方组２Ｅ２（３３．２８±３．５７）ｐｍｏｌ／Ｌ 与滋阴方组３Ｅ２ （３３．８５±
２．３０）ｐｍｏｌ／Ｌ 均明显高于模型组１（Ｐ＜０．０５）。
２ 对照组、模型组１ 与滋阴方组大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达情况、ＩＧＦ－１灰度值比较 模型组１ 大鼠 ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表
达（１．０２±０．０３）明显高于对照组（０．１３±０．１９）（Ｐ ＜０．０５），且
ＩＧＦ－１灰度值（１５４．９３±８．１７）明显小于对照组（１６９．２０±２．６８）；滋阴方组２ ＧＣ ＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达（０．２３±０．０７）与滋阴方组 ３
ＧＣＳＣＦ ｍＲＮＡ 表达（０．２０±０．１４）均显著低于模型组１（Ｐ ＜０． ０５），滋阴方组３ＩＧＦ－１灰度值（１６７．０３±４．２６）明显高于模型组
１（Ｐ＜０．０５）。
３ 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比较 模型组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面Ｔ 为（４．８９±０．４５）ｎｇ／ｍｌ，明显高于对照组（４．１１±０．
４７）ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）；补阳方组２Ｔ（４．３５±０．２６）ｎｇ／ｍｌ与补阳方组３Ｔ（４．３２±０．２９）ｎｇ／ｍｌ明显低于模型组（Ｐ ＜０．０５），而补阳方组１Ｔ 水平与模型组的比较无显著差异（Ｐ ＞０．０５）；５ 组 ＳＣＦ 水平比较无显著差异（Ｐ＞０．０５），见表１。
表１ 对照组、模型组与补阳方组大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞里面Ｔ、ＳＣＦ 水平比较（珚ｘ±ｓ）
组 别 ｎ ＳＣＦ（ｐｇ／Ｌ） Ｔ（ｎｇ／ｍＬ）
阳方组
３采用含
２０％
补阳方药相应血清培养液进行研究；空白
对照组采用原代培养所得正常大鼠卵巢部位黄素化颗粒细胞进行研究；模型组采用模型组大鼠所得卵巢部位黄素化颗粒细胞进行研究。
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