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“恒远生物”产品文献：对寻常性 Th17 / Treg 细胞分化的影响
阅读：577 发布时间：2019-4-4Ｒunx3 对寻常性银屑病患者 Th17 / Treg 细胞分化的影响及其作用机制
付丹丹1 ，宋向凤2 ，李占国1 ，李敏1 ，刘冬1 ，夏永华1 ，田中伟1
［摘 要］ 目的 探讨 Ｒunx3 对银屑病患者 Th17，Treg 细胞分化的影响及作用机制。方法 收集 58 例银屑病患者和 50 例健康对照者血液样本，应用密度梯度离心法分离外周血 CD4 + T 细胞，qＲT-PCＲ 检测 Ｒunx3的 mＲNA 水平; 采用 ＲNA 干扰法下调 Ｒunx3 的表达水平，流式细胞仪检测 Th17 和 Treg 细胞水平; ELISA 法测定外周血 IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 含量; 实时定量 PCＲ 法检测 ＲOＲγt，Foxp3 的 mＲNA 水平。结果 与对照组相比，银屑病患者外周血 CD4 + T 细胞中 Ｒunx3 的表达明显升高。Ｒunx3-siＲNA转染后，Th17 / Treg 细胞比值降低，同时伴随有 Th17 型炎性因子 IL-17，IL-23 表达下降以及 Treg 型抗炎因子 TGF-β，IL-10 的上调?；品治鲋な担襲nx3 沉默后，细胞中 Th17 转录因子 ＲOＲγt 明显下降，而 Treg 转录调节因子Foxp3 水平增加。结论 Ｒunx3 可通过ＲOＲγt，Foxp3 调控CD4 + T 细胞向Th17，Treg型细胞的分化，影响银屑病患者 Th17 / Treg 比例的失衡，提示其可作为银屑病防治的新方向。
［关键词］ 银屑病; Ｒunx3; CD4 + T 细胞; Th17 / Treg; 转录因子
［中图分类号］ Ｒ 758． 63 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1001 － 7089( 2015) 11 － 1107 － 05
［DOI］ 10. 13735 / j. cjdv. 1001-7089. 201505066
Effect of Ｒunx3 on Th17 / Treg Cells Differentiation in Psoriasis and the Underlying Mechanism
FU Dan-dan1 ，SONG Xiang-feng2 ，LI Zhan-guo1 ，LI Min1 ，LIU Dong1 ，XIA Yong-hua1 ，TIAN Zhong-wei1
( 1. Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University， Weihui 453100，China;
2. Immunology Department of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China)
［Corresponding author］ TIAN Zhong-wei ，E-mail: zhonwt@ 163. com
［Abstract］ Objective To investigate the function and the underlying mechanism of Ｒunx3 on Th17 and Treg cells dif- ferentiate in psoriasis. Methods Fifty eight patients with psoriasis vulgaris and 50 healthy controls were en- rolled in our study and their peripheral blood samples were obtained. CD4 + T cells in the peripheral blood samples were isolated by density gradient centrifugation. The mＲNA levels of Ｒunx3 in CD4 + T cells were an- alyzed by qＲT-PCＲ. After silencing the expression of Ｒunx3 by its specific siＲNA，flow cytometry was per- formed to determine the percentage of Th17 and Treg cell. The secretions of IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 were analyzed by ELISA. Furthermore，the mＲNA levels of ＲOＲγt，Foxp3 were determined by qＲT-PCＲ. Ｒesults The expressions of Ｒunx3 in peripheral blood CD4 + T cells were significantly increased in patients with psoriasis compared with the control groups. Additionally，Ｒunx3 knockdown significantly decreased the ratio of Th17 / Treg cells． Furthermore，Ｒunx3 knockdown down-regulated the expression of IL-17 and IL-23，but up-regulated TGF-β and IL-10 expression. The mechanism investigation revealed that Ｒunnx3 knockdown significantly inhibited the expression of Th17-specific transcription factor ＲOＲγt，while promoted the level of Treg-specific transcription factor Foxp3. Conclusion Ｒunx3 may affect the imbalance of Th17 / Treg levels in patients with psoriasis by regulating their specific transcription factor ＲOＲγt and Foxp3，suggesting a po-
tential target for prevention and treatment of psoriasis.
［Key words］ Ｒunx3; CD4 + T cells; Th17 / Treg; Transcription factor
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［基金项目］ 1. 河南省教育厅科学技术研究重点项目( 13A320852) ; 2. 新乡市重点科技攻关计划项目( ZG13022) ; 3. 河南省卫生科技创新型人才工程( 201004159)
［作者单位］ 1. 新乡医学院附属医院皮肤性病科，河南 卫辉 453100; 2. 新乡医学院免疫学教研室，河南 新乡 453000
［通讯作者］ 田中伟，E-mail: zhonwt@ 163. com
［网络出版时间］ 2015-10-08 14∶ 44 ［网络出版地址］ http: / / www． cnki． net / kcms / detail /61． 1197． Ｒ． 20151008． 14∶ 44． 006． html
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中国皮肤性病学杂志 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期 Chin J Derm Venereol，Nov. 2015，Vol. 29，
银屑病( psoriasis) 是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常的炎症性皮肤病，其 发病机制依旧是国内外的研究热点。CD4 + T 淋巴细胞在不同的条件下可分化成不同亚型的 T 淋巴细胞， 包括 Th1 型、Th2 型、Th17 型效应细胞及调节性 T 细胞( regulatory T cell，Treg ) ，执行不同的生物学功能［1］。其中，Th17 和 Treg 细胞在自身免疫性疾病、感 染性疾病和肿瘤等病理过程中发挥重要作用［2］。近 年来的研究发现，银屑病患者体内 Th17 细胞异?；罨?，而 Treg 细胞的增殖及功能不足，表明 Th17 / Treg 细胞的失衡有可能参与了银屑病的病理进程［3］，提示恢 复银屑病患者体内的 Th17 / Treg 平衡将成为该病防治的重要方向。Th17 和 Treg 的分化分别受转录因子ＲOＲγ 和 Foxp3 的调控 ［4-5］。
Ｒunt 相关转录因子 3 ( runt-related transcription factor 3，Ｒunx3) 是一种肿瘤抑制基因，广泛表达于骨髓、脾脏、胸腺、外周血、脊髓细胞、T 细胞、B 细胞和成熟的树突状细胞( dendritic cell，DC) 中［6］。近年来研 究发现，Ｒunx3 与多种免疫细胞的发生发育也有关，尤其在淋巴细胞发生、发育及成熟中发挥重要作 用［7］。Th17 细胞的分化可受 Treg 细胞的调控，在强烈的 T 细胞受体信号和抗原提呈细胞存在下，Treg 细胞可分泌 IL-17，并转化为 Th17 细胞［8］。Lequn Li 等［9］发现 Ｒunx3 参与了 Treg 细胞转化的过程。Apel M 等［10］发现，Ｒunx3 基因突变与银屑病关节炎的发生 相关。研究发现，Ｒunx3 在银屑病患者中外周血中的表达具有特异性［11］。因此，本研究分析了 Ｒunx3 对银屑病患者外周血 CD4 + T 细胞分化为 Th17，Treg细胞的影响，并分析了相应的调控机制，从而为银屑病 的防治提供新的研究方向。
1材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 研究对象 入选病例为 2013 年 11 月 － 2014 年 3 月在本院皮肤科门诊确诊的寻常性银屑病患者58 例，其中男 31 例，女 27 例，年龄 14 ～ 65 岁，病程 6 个月 ～ 25 年。排除其他病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤等。对照组为本院体检中心健康体检者 50 例，男28 例，女 22 例，年龄 18 ～ 59 岁，采集血样前 1 个月内无感染情况，既往无银屑病、血管炎等免疫相关性皮肤 病病史。两组在性别、年龄上差异无统计学意义( F =
1. 88，P ＞ 0. 05 ) 。本次研究获得医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。
1. 1. 2 主要试剂 人淋巴细胞分离液和 ＲosetteSep 富集人 CD4 + T 细胞抗体( Stem Cell 公司) ; 胎牛血清 ( 浙江天杭生物科技有限公司) ; Trizol、Lipofectamine
2000 ( Invitrogen 公司) ; SYBＲ Master Mixture( 北京厚生博泰科技有限公司) ; Ｒunx3 siＲNA( 上海吉玛制药技术有限公司) ; IL-17，IL-23，TGF-β，IL-10 ELISA 试
剂盒 ( 上海恒远生物科技有限公司) ; PE-IL-17，PE- CD3，PE -CD25，FITC-CD4，FITC-CD8，APC-Foxp3 ( 美
国 eBioscience 公司) ; ＲOＲγt，Foxp3 抗体( Cell Signal Technology) 。
1. 2 方 法
1. 2. 1 标本采集 无菌操作下采集所有研究对象静脉血 10mL，肝素钠抗凝，6h 内用 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法获取细胞。具体操作如下: 向血样中加入50 μL ＲosetteSep 富集人 CD4 + T 细胞抗体混合物，混匀，室温孵育 20 min。用等体积含 2% FBS 的 PBS 稀释血液，向 10 mL 淋巴细胞分离液的上面缓慢加入稀释的血液样品，血液与淋巴分离液的比例为 2: 1，室温 1 200 r / min离心 20 min。收集位于淋巴细胞分离液与血浆界面之间的灰色细胞层。加入 5 倍体积含 2% FBS 的 PBS 混匀，800r / min 离心 10 min，弃上清，重复 1 次。流式细胞仪检测 CD4 + T 细胞纯度可达 90% 以上。
1.2. 2 总 ＲNA 的提取 取 1 × 106 CD4 + T 细胞，加入1 mL 预冷 Trizol，吹打细胞至*溶解，室温静置 5 min。严格按照 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂说明书进行操作。后得到 ＲNA 沉淀溶于 10μL DEPC 水中。取 ＲNA 溶解液置于紫外分光光度仪中进行 ＲNA 浓度测定，读取 260nm 与 280nm 的 A 值，利用 A260 / A280 的比值( Ｒ) 估计核酸的纯度，Ｒ 值范围控制在 1. 8 ～
2.0 之间。按照 TaKaＲa 公司逆转录试剂盒说明书进行，首先除去基因组 DNA，依次加入 gDNAEraser Buffer 2μL，gDNAEraser1 μL，ＲNA 1 μg，用 ＲNase Free dH2 O调整制成 10 μL 反应液，42℃ 静置 2 min，之后进行逆转录。逆转录反应体系如下: PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScriptＲTEnzyme Mix 1 μL，ＲTPrimeMix 1 μL，步制成的 10 μL 反应液，后用 ＲNaseFreedH2 O 将体积调为 20 μL。反应条件: 42℃ ，反应 60 min，70℃ 10 min 灭活逆转录酶，得到 cDNA 产物。
1. 2. 3 实时定量检测 Ｒunx3，ＲOＲγt，Foxp3 mＲNA 水平 实时定量 PCＲ( qＲT- PCＲ) 检测 mＲNA 的表达水平，以 β-actin 基因为内参照，引物序列见表 1。PCＲ 反应体系为 12. 5 μL SYBＲ Premix Ex Taqprimer，1 μL引物，2 μL 模板，其余用 ddH2 O 补齐至 25μL。PCＲ 循环参数为: 94℃ 预变性 5 min，1 个循环，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环扩增，后 72℃ 5 min 结束反应。
1. 2. 4 Ｒunx3 siＲNA 转染
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