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荧光定量PCR操作中有哪些事项要注意的呢？
阅读：3803 发布时间：2020-8-11
荧光定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光报告系统，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，实现对起始模板的定量检测。
荧光定量PCR属于精密性试验，需要专业人员操作，在操作过程中需要注意各方面细节实验以保证实验的可靠可重复性。
1、荧光定量PCR操作注意点：
实验室注意分区：试剂准备间，样本处理间，PCR室，电泳间要有明确区分，各房间实验室的实验服不得混用；
试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度的核酸模板（如高浓度的标准品，PCR产物，miRNA的minics等）；
减少频繁多次的走动，尤其去过电泳间之后当天不可进入其他房间；
使用生物安全柜加样，不同位置的移液器不可混用，不要随意更换其位置；
在检测体系中添加UNG酶系统用于避免PCR产物的污染。
2、试剂质量控制：
对每批次配制或购买的试剂进行质检，保证试剂的性能稳定可控，均一。
3、试剂使用注意事项：
试剂使用前必须混匀。
4、移液器操作注意事项：
使用结束后调整至大量程，取样时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间，避免外壁沾过多试剂随加样进入导致重复性不好。
5、反应液配制及注意事项：
加样使用合适量程的移液器；对于较小体积的移液，取液时候，不可深入液体太多以免试剂沾到吸头外壁至移液量不准确，深入1-2mm即可（尤其是粘稠试剂，如酶，甘油等）；
小体积试剂加样务必：取液后眼观是否取到液体，加样务必浸入混合液一下吹吸数次，弃吸头前眼观确定吸头中无残留。
6、反应液分装及注意事项：
反应液分装前必须混匀（比如涡旋震荡或移液器吹吸混匀）再分装；反应液第一个孔分装必须润一下枪头，96孔之间加样间隔时间尽量保持一致，96孔的点样位置尽量保持在96孔的相同位置，复孔之间尽量相邻点样，点样按照一定的顺序，吸取时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间；
加样使用移液器镶紧移液器吸头，每次按至第一档即可，不可按至第二档，避免气泡产生和加样不准确（注：这个并不是使加样准确的方式，只要保持所有孔的加样方式相同，可减少加样误差；）加样尽量匀速，不要加样到孔外面，以免对后面封膜造成影响。