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PCR扩增反应的步骤和影响因素分析
阅读：5841 发布时间：2020-7-13
PCR(Polymerase Chain Reaction)，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
防止污染的首要原则是要设置NTC(No Template Contro|)对照，一个不含有模板DNA但含有PCR体系中所有其他成分的对照。如果不能在污染的第一时间发现，会导致后续一系列的数据无法使用。准备PCR体系的移液器要，千万不能用吸取过PCR产物的移液器去准备PCR体系。
经典的PCR扩增反应分为三步：
1、高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、低温退火：模板DNA与引物的复性，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、适温延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶的作用下，以核苷酸为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
影响扩增的因素：
1、由于各种原因，造成的PCR扩增体系中出现了非目的检测样本本身的模板，使得PCR结果出现假阳性
2、操作错误或者误差造成的模板间交叉污染
3、PCR试剂的污染
4、PCR实验器材的污染
5、PCR扩增产物的气溶胶污染
防止污染的首要原则是要设置NTC(No Template Contro|)对照，一个不含有模板DNA但含有PCR体系中所有其他成分的对照。如果不能在污染的第一时间发现，会导致后续一系列的数据无法使用。准备PCR体系的移液器要，千万不能用吸取过PCR产物的移液器去准备PCR体系。