小鼠肿瘤浸润组织白细胞分离液试剂盒（细胞培养及分子生物学）说

明书

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

 名称 产品编号 规格

A 各种动物组织白细胞分离液 详见附录 1 100ml

B F 液（赠品） F2013TBD 100ml

C 红细胞裂解液（赠品） NH4CL2009 100ml

D 全血及组织稀释液（赠品） 2010C1119 100ml

E 细胞洗涤液（赠品） 2010X1118 100ml

注：本试剂内容中各单品可根据货号单独购买，客户可根据实际使用情况自行选择购买。

【预期用途】

适用于从动物组织中分离白细胞，无菌条件下所分离的白细胞可用于分子生

物学及细胞培养等。本品仅供科研使用。

【检验原理】

本分离液为 FICOLL、羟乙一基淀粉 550 与泛影酸葡甲胺的混合液?？鼓?/span>

可在分离液中分层。离心时，在 FICOLL、羟乙一基淀粉的作用下红细胞与粒细胞

聚集并迅速沉降；此时，白细胞仍处于分离液上层及分离液层，红细胞污染可通

过红细胞裂解液裂解红细胞去除。大部分血小板可在细胞清洗低速离心过程中去

除。

其他人及动物多种比重细胞分离液，因不同种属不同比重分离液的细胞离散

系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属

及被分离细胞的名称。

【*但不提供的仪器及耗材】

可提供 400g 离心力的水平转子离心机、15ml 玻璃离心管、吸管及标准胎牛血清

（产品编号：TBD31HB）等。

【注意事项】

1. 使用前，本分离液需复温至 18-22℃。为获得*的实验结果，在获得

样本 2 小时内进行实验，存放时间越长细胞活性越低。

2. 实验过程中，如需匀浆组织或洗涤细胞，不可使用含 Ca、Mg 离子的缓冲液及

培养液，其成分会大大降低细胞得率及纯度。本公司生产的全血及组织稀释液和

细胞洗涤液不含 Ca、Mg 离子、低内毒素水平且含细胞和保护成分，推荐使用。

3. *抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素，其他抗凝剂也可使用，但会影响细

胞活性。

4. 实验操作时，不可使用含粉手套、不可使用内毒素含量过高的液体，手套中

的粉末颗粒及高内毒素会激活细胞从而降低细胞得率及活性。建议使用天津灏洋

配套相关产品。

5. 本实验不可使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，其带有的静电作用

将导致细胞贴壁影响分离效果。

6. 吸取过多的白细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使

混杂的粒细胞数量增加。

7. 吸取过多的白细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

8. 如需进行细胞计数，则需样本贮藏时间不得多于 10 小时，否则将导致细胞被

激活，得率降低。

9. 为去除所混杂的血小板，可在分离液上层加上 4-20%蔗糖梯度等渗溶液进行

二次离心。

10. 细胞纯度可在步骤 10 后使用瑞氏染色方法确定，细胞活性可用台盼蓝处理

后观察。

11. 如所实验后细胞得率或活性过低，请天津灏洋以寻求帮助，具

体详见“【生产企业】”项目下内容。

【组织单细胞悬液的制备方法】

注： A. 组织匀浆液需先用现配，配制方法为：40ml 胎牛血清与 60mlF 液混匀，备用（现

用现配）。

B．本试剂盒中不包含胶原酶，若采用酶消化法制备单细胞悬液，请用户根据各实验

室要求另购不同类型胶原酶。

Ⅰ. 剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液；用眼科剪将组织剪至

匀浆状，加入 5ml 组织匀浆液；用吸管吸取组织匀浆，用 100 目不锈钢滤网(另

购)过滤到试管内；离心沉淀 1500 转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗 3 次，每

次以 500rpm 短时低速离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网（另购）过滤去

细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待

测细胞的活力。分离前用全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108

-1×109个/ml

的单细胞悬液备用。

Ⅱ. 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入 70ml 组织研磨器内，加入 2ml

组织匀浆液；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用 5ml 组织匀浆液冲洗研器；收集细

胞悬液，经 200 目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀 800rpm×2min ，再用细

胞洗涤液洗 3 次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。MANUFACTURE CO.,LTD - 3 -

www.tbdscience.com◆:gx

灏洋生物 TBDsciences

常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108

-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。

Ⅲ. 酶消化法：

A． 用 F 液将胶原酶稀释，终浓度为 400 U/ml，至于冰浴备用。

B． 取一适当大小培养皿进行操作：用镊子夹碎动物脾脏，加入稀释后的胶原酶，

37℃消化 20 分钟。

C． 以 100 或 200 目不锈钢滤网（另购）过滤，离心沉淀 800prm×2min ，再用

细胞洗涤液洗 3 次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107

个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用全血及组织稀释液悬起细

胞浓度为 2×108

-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板

（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬

液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，

均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1）、在细胞计数板中央放置计数的盖玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流

出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上

线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）、按下式计数细胞悬液的密度：

细胞密度＝（4 个大格细胞总数/4）×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

细胞计数要点：

A． 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml，如果细胞数目很

少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成

的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细

胞数<200 个/10mm2或>500 个/10 mm

2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

B． 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

C． 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次

取样都要混匀，以求计数准确；

D． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计

算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要

重新计数。

初学者易犯的错误：

A． 计数前未将待测悬液吹打均匀。

B． 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

C． 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

【检验方法】

1. 取一支 15ml 离心管，加入 3ml 分离液置于 18-22℃。

2. 取 3ml 细胞悬液小心加于分离液之液面上。18-22℃，400g 离心 20 分钟。低

温（如 4 度）离心会降低细胞得率。

3. 离心后，用吸管小心吸出分离液上层（包含白细胞的细胞层）0.5cm 以上的

上清液部分，弃去。

4.用吸管小心吸取分离液层、白细胞层及红细胞层置于另一新离心管内。

5. 在步骤 4 中所得离心管中加入 10ml 细胞洗涤液（产品编号：2010X1118）混

匀。

6. 250g 离心 10 分钟。

7. 弃上清，沉淀使用红细胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解红细胞（裂解过程

参见下述【红细胞裂解液使用说明】）。

8. 裂解后再经三次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后即为所需白细胞。

9.后以 0.5ml 后续试验所需相应液体重悬细胞。

WBC Separation Medium

【红细胞裂解液使用说明】

本裂解液有别于市场上销售的其它红细胞裂解液，其配方经过本公司优化在裂解红细

White Blood

Cell

20 Minutes

Cell Suspension Diluentwww.tbdscience.com

本品只能用于科学研究，不能用于临床检测

胞的同时不损伤并在一定程度上?；ち馨拖赴?/span>(lymphocyte)或其它有细胞核的细胞，所获

得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。另外，本裂解液中无DNA及RNA酶，配

合细胞分离液使用所提细胞可广泛用于细胞培养及分子生物学实验，请广大用户从优选择。

红细胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也称ACK Lysis Buffer，是一种用于

从人或鼠等的血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。

本裂解液不适用于有细胞核红细胞的裂解，例如鸟或禽类的红细胞。本裂解液经过无菌

处理，处理过的血液或组织细胞样品可以用于后续的原代培养、细胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各种常规的分析和检测。

使用说明：

A. 对于组织细胞样品：

a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

b. 加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体

积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心

2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀

体积的5倍。4℃离心效果更佳。

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

B. 对于组织细胞样品无需洗涤的快速操作步骤：

a. 新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。

b. 对于0.2ml细胞沉淀加入1ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。本步骤在室温

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

d. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

e. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，

时不需要大体积的离心管?？焖俨街枭倭艘淮卫胄?，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

C. 对于血液样品：

a. 取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。

b. 加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体

积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠

的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂

解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

e. 洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心

2-3分钟，弃上清?？稍僦馗?/span>1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀

体积的5倍。4℃离心效果更佳。

f. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于微量或少量的血液样品，可以在*步中不进行离心弃上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液体积的红细胞裂解液，并在室温或4℃裂解4-5分钟。对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外

周血，宜延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞

裂解。后续步骤相同。

D. 对于血液样品无需洗涤的快速操作步骤：

a. 每1ml新鲜抗凝血中加入10ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解4-5分钟。本步骤在室

温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解4-5分钟已经足够，对于人的外周血，宜

延长裂解时间至10分钟，但通常不宜超过15分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促

进红细胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，混匀。

c. 400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

d. 如果发现红细胞裂解不*，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不

会影响后续的一些检测。

e. 根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。

注：对于常规步骤，多一步洗涤过程的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时

不需要大体积的离心管?？焖俨街枭倭艘淮卫胄?，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。

【储存条件及有效期】 www.tbdscience.com

18-25℃避光保存，有效期 2 年。启封后置 4℃保存，溶液变浑浊或感染细

菌时，产品失效。本品为真空包装，未启封前置于 10℃ 以下易出现白色结晶，

影响分离效果。

【适用仪器】

半径 15cm 水平转子离心机。

【样本要求】

本分离液要求样本为新鲜的细胞悬液，样本收集时应无菌操作且在储存、处

理和运输过程中避免冷冻和冷藏。

【参考值（参考范围）】

本实验白细胞的提取率及纯度均大于 80%。

【检验结果的解释】

由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能

影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心的时间，摸索*的分离条件（具

体分离条件各实验室自定）。

【检验方法的局限性】

本试验要求，在正常大气压下，样本、分离液及分离环境温度为 18-22℃。

本分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。

【产品性能指标】

pH 7.0-7.5

渗透压 280-340mOsmol/kg

无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清

澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以

下，含 25μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【参考文献】

1 郑德先，吴克复，褚建新.现代实验血液学研究方法与技术.北京医科大学

协和医科大学联合出版社，1999

2 鄂征.组织培养.北京出版社，1995

3 朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社，2000