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3H-TdR摻入法檢測(cè)IL-2的生物活性

2012-3-10  閱讀(1202)

【材料和試劑】
(1)         反應(yīng)細(xì)胞:CTLL-2,存活率應(yīng)>95%。
(2)         IL-2標(biāo)準(zhǔn)品:倍比稀釋為不同濃度。
(3)         待測(cè)樣品:倍比稀釋為不同濃度。
(4)         10% Fcs-RPMI-1640*培養(yǎng)液
(5)         3H-TdR
(6)         96孔培養(yǎng)板,刻度吸管,毛細(xì)吸管,刻度離心管,離心機(jī),加樣器(頭),細(xì)胞計(jì)數(shù)板,倒置顯微鏡,超凈工作臺(tái),CO2培養(yǎng)箱,微量細(xì)胞收集儀,玻璃纖維濾紙,ß液閃計(jì)數(shù)儀。
【操作步驟】
(1)   用10 %FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細(xì)胞2次,1000r/min離心5min,以去除原生長(zhǎng)培養(yǎng)液(含IL-2);
(2)   用10% Fcs-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml;
(3)   將不同倍比稀釋度的IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,100μL/孔,各設(shè)3復(fù)孔,同時(shí)設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照;
(4)   各孔均加入CTLL-2細(xì)胞懸液,100μl/孔 ;
(5)   置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
(6)   每孔均加入3H-TdR,0.5μci/孔  ,繼續(xù)培養(yǎng)4-6h;
(7)   用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上,用ß液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定各孔cpm值。測(cè)定CPM值的*時(shí)間應(yīng)是培養(yǎng)液對(duì)照(無IL-2)細(xì)胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)。
【結(jié)果分析】
(1)         每孔cpm值為了復(fù)孔的平均值,再減去培養(yǎng)液對(duì)照,即為各孔zui終c
(2)         計(jì)算IL-2活性單位(參見IL-1、IL-2的MTT比色檢測(cè)法)可按下式計(jì)算:
 

樣品IL-2活性單位
(U/ml)
=
達(dá)50%zui大增殖3H-TdR滲入值的樣品稀釋度
×
標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位
(U/ml)
達(dá)50%zui大增殖3H-TdR滲入值的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度

 
【注意事項(xiàng)】
(1)   用125I-UdR代替3H-TdR進(jìn)行IL-2活性檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是不需ß液體閃爍測(cè)定所需的試劑和設(shè)備,只需一臺(tái)小型γ計(jì)數(shù)儀即可,并可節(jié)省時(shí)間和減少ß液體閃爍操作中出現(xiàn)的誤差。其缺點(diǎn)是125I-UdR半衰期較短,需要定期供應(yīng)?;痉椒ㄍ?sup>3H-TdR摻入法,只是用125I-UdR代替3H-TdR,0.2μci/孔  ,然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl,繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定cpm值。
(2)   其余注意事項(xiàng)可參見MTT法檢測(cè)IL-2活性部分。


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