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恒远告诉大家：WB实验的常见问题答疑（2）
阅读：1785 发布时间：2012-8-7上海恒远生物科技有限公司是一家生物技术企业，主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发、销售。并代理销售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家国外，致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供*的科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？
答：a）抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。b）蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等
12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？
答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。
答：可能是：a）样品浓度过低；b）转移时间不够，。
13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，能多加几中种蛋白酶抑制剂。
16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？
答：一般5×10^6就足够了
17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？
答：能，没有问题。
18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经?；岱⑾种挥幸徊糠值鞍鬃搅四ど希褪窃谧ず笕窘悍⑾钟械目姿械牡鞍滋醮荚?，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，能多加几中种蛋白酶抑制剂。
16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？
答：一般5×10^6就足够了
17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？
答：能，没有问题。
18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经?；岱⑾种挥幸徊糠值鞍鬃搅四ど希褪窃谧ず笕窘悍⑾钟械目姿械牡鞍滋醮荚?，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇
上海恒远生物科技有限公司提供试剂盒代测以及实验室外包服务，如果你想了解更多关于western blot实验的详细信息，来函！