邱模昌，蔡靈卿，王 芳，劉建明，程暢河

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，江西  上饒３３４０００）

摘要：目的     研究β－胡蘿卜素（β－Ｃ）對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法     在血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)至８０％ 以上融合時(shí)，將其分為５組：正常對(duì)照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組，每組６ 個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，高糖損傷組加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，低、

中和高劑量β－Ｃ 組分別加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１ ＋１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 。各組放置５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４８ｈ后，收集細(xì)胞或培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、采用  ＭＴＴ 比色法檢測(cè)５ 組血管內(nèi)皮細(xì)

胞存活率，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、血管內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧（ＲＯＳ）水平，使用全自動(dòng)生化儀、采用乳酸→丙酮酸連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)５組血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（ＬＤＨ）活性，使用全自動(dòng)生化儀、采用硫代巴比妥酸比色定量法檢測(cè)５組血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛（ＭＤＡ）的水平；先參照   ＮＯ 檢測(cè)試劑盒的使用說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)５組血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，高糖損傷組的血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平均明顯降低，血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中 ＬＤＨ 活性、

ＭＤＡ 水平，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、血管內(nèi)皮細(xì)胞中 ＲＯＳ水平均明顯升高（均 Ｐ＜０．０１）；與高糖損傷組比較，中、高劑量β－Ｃ 組的血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平均明顯升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中 ＬＤＨ 活性、ＭＤＡ 水平及低、中和高劑量β－Ｃ 組的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、血管內(nèi)皮細(xì)胞中 ＲＯＳ水平均明顯降低（Ｐ＜０．０５或

Ｐ＜０．０１）。結(jié)論    β－胡蘿卜素對(duì)高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加 ＮＯ 水平和

促進(jìn) ＲＯＳ的降解有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；β－胡蘿卜素；高糖；血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；活性氧；臍靜脈；保護(hù)作用

中圖分類號(hào)：Ｒ９６；Ｒ５８７．１      文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ       文章編號(hào)：２０９５－４７２７（２０１４）０７－００２４－０５

β－胡蘿卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ，β－Ｃ）是常見類胡蘿卜素之一，類胡蘿卜素呈現(xiàn)很強(qiáng)的抗氧化性，具有清除

自由基、保護(hù)血管、抗腫瘤、護(hù)膚、增強(qiáng)免疫功能及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用。有研究［７］發(fā)現(xiàn)，β－Ｃ 能充分提

高 ＮＯ 的水平和生物利用度，舒張血管，保護(hù)血管，

同時(shí)β－Ｃ 還能抑制 ＲＯＳ水平的升高，保持機(jī)體抗氧化能力和不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間的動(dòng)態(tài)平衡，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生，但β－Ｃ 對(duì)高糖

誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)目前研究較

少。本研究觀察了β－Ｃ 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)，并從 ＲＯＳ與 ＮＯ 途徑探討β－Ｃ 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制。

１ 材料與方法

１．１  實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 購自中南大學(xué)（源自 ＡＴＣＣ 細(xì)胞庫），ＤＭＥＭ 培養(yǎng)基（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司），ＭＴＴ 溶液、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、

ＬＤＭＳＯ、乳 酸 脫 氫 酶 （ＬＤＨ ）試 劑 盒 和 丙 二 醛

（ＭＤＡ）試劑盒（海門市碧云天生物技術(shù)研究所），

沙長(zhǎng)錦應(yīng)用技術(shù)研究所），６５２ 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國ＢＩＯ－ＲＡＤ 公司），ＤＸＣ６００全自動(dòng)生化分析儀（美國 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司），ＦＡＣＳＣ－ＡＬＩＢＵＲ 流式細(xì)胞儀

（美國ＢＤ 公司）。

１．２  實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１  血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組、加藥方法

１）將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 傳代至第３代后用２０％ＤＭＥＭ（含１０％ 胎牛血清）懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以５×１０３／孔的細(xì)胞數(shù)接種于六孔板培養(yǎng)板中，待 細(xì)胞長(zhǎng)至 ８０％ 以上融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

２）在血管內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)至８０％ 以上融合時(shí)，將其分為

５組：正常對(duì)照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組，每組６個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，高糖損傷組加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，低、中和高劑量β－Ｃ 組分別加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１＋１０％葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１。各組放置５％ＣＯ２  培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４８ｈ后，收集細(xì)胞或培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。３）將傳代至第３代的血管內(nèi)皮細(xì)胞分為５組：正常對(duì)照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組。

１．２．２  血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的檢測(cè)

將５ 組 （傳 代至第 ３ 代的血管內(nèi)皮細(xì)胞）用２０％ＤＭＥＭ（含１０％胎牛血清）懸浮細(xì)胞后，以每孔１０３  的 細(xì) 胞 數(shù) 接 種 于 ９６ 孔 板 培 養(yǎng) 板 中，每 孔２００μＬ，每組接種６ 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后８ｈ 后加藥，正常 對(duì)照組、高 糖損傷組及低、中 和高劑量β－Ｃ組加藥同１．２．１ 段。加藥后，放置５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ｈ。培養(yǎng)２４ｈ后，每孔加入 ＭＴＴ 溶液（５ｇ·Ｌ－１ ）１５μＬ，再放置 ５％ＣＯ２  培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４ｈ。培養(yǎng)４ｈ后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。

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