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技術(shù)文章

ELISA法細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作步驟

閱讀:1544          發(fā)布時(shí)間:2014-9-16

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp~200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法,應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體,與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu),可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的核小體片段。

常見樣本以及基本操作方法:

1.收集細(xì)胞,離心后,用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮,室溫下作用30min。(培養(yǎng)細(xì)胞的上清液、血漿和血清都可作為檢測(cè)樣本)

2.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液,加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。

3.加入80µl免疫反應(yīng)試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物素及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合),室溫下孵育2h(置搖床上,250r/min)。

4.取上清,用300µl溫育緩沖液洗滌3次,小心移去洗滌液。

5.加入100µl底物緩沖液,室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。

6.盡快作比色分析(10min~20min內(nèi)),用底物緩沖液作空白對(duì)照,以波長(zhǎng)405nm,參考波長(zhǎng)492nm進(jìn)行檢測(cè)。

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