TRAP－PCR銀染法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
凱基TRAP－PCR銀染法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
（TRAP-silver staining omerase Detection Kit ）
Cat number：KGA412 For Research Use Only
Store at-20℃ for one year
Expire date：20101208
一、試劑盒說明
端粒酶是合成染色體末端的端粒的酶。端粒（omere）是真核生物染色體的天然末端，由上千個(gè)6堿基重復(fù)序列組成（TTAGGG）組成，是細(xì)胞必需的遺傳組分，它的作用是維持端粒有足夠的長(zhǎng)度，保證基因信息在復(fù)制過程的準(zhǔn)確性，以防止染色體末端遺傳信息的丟失。在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞分裂周期都會(huì)使端粒變得越來越短，當(dāng)端粒短到一定程度就會(huì)發(fā)出信號(hào)，細(xì)胞停止分類。
端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)亞基組成，是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，在細(xì)胞染色體復(fù)制過程中，能夠以自身RNA為模板，在染色體3’末端合成重復(fù)序列，維持端粒的長(zhǎng)度。正常人體細(xì)胞中不能檢測(cè)出端粒酶活性的表達(dá)，而腫瘤細(xì)胞株及大多數(shù)腫瘤組織中的端粒酶活性卻異常的高表達(dá)。因此對(duì)組織或細(xì)胞中端粒酶活性的檢測(cè)具有重要意義。TRAP－銀染法端粒酶活性檢測(cè)試劑盒是采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增的方法，利用銀染技術(shù)檢測(cè)端粒酶的活性。陽(yáng)性結(jié)果在凝膠電泳上顯示相隔6 bp的梯狀條帶，條帶的深淺表示端粒酶活性的大小。TRAP-銀染法保留了傳統(tǒng)TRAP法靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間，避免了同位素的放射污染。
本試劑盒適用于培養(yǎng)細(xì)胞及新鮮組織端粒酶活性檢測(cè)，與通常的端粒酶活性測(cè)定法相比較，具有以下特征：
內(nèi)標(biāo)與端粒酶提取液在同一管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；
優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，是PCR效果進(jìn)一步提高
二、試劑盒組份
| 組份 | KGA412 （20 assays） | KGA413 （50 assays） | KGA414 （100 assays） | 儲(chǔ)存條件 |
| Wash buffer | 20 mL | 50 mL | 100 mL | 40C |
| Lysis buffer | 1.2mL | 3.0 mL | 5.0 mL | 40C |
| 10×TRAP buffer | 100μL | 250μL | 500μL | 40C |
| dNTPs | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| Taq-DNA polymerase | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| TS primer | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| CX primer | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| 內(nèi)標(biāo)引物 | 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
| 20μL | 50μL | 100μL | -200C |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
高速冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩儀、PCR擴(kuò)增儀、微量移液器、DEPC水處理并滅菌的槍頭、離心管等
PBS、1M DTT、PMSF（100mM溶于異丙醇）、0.5Mβ-巰基乙醇、DEPC水
蛋白定量試劑及儀器（可選購(gòu)凱基Bradford法或BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒）
聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染相關(guān)儀器及試劑（具體參見操作方法）
四、操作方法
建議使用經(jīng)DEPC水處理并滅菌的槍頭、離心管等實(shí)驗(yàn)器材
1． 細(xì)胞端粒酶或組織標(biāo)本端粒酶的提取
1.1 用PBS洗滌細(xì)胞二次（離心2000rpm，5min）收集1~2×106細(xì)胞；若是組織標(biāo)本，稱取40-100mg左右的組織，用PBS洗滌后，研碎；
1.2 加入1ml冰冷的Wash buffer （使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT），懸浮上述樣品，置冰上5min；
1.3 4oC，離心 （10,000 rpm，5min），棄上清；
1.4 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入2μLβ-巰基乙醇（0.5M溶于水，一般市售純液體為14.3M）]，懸浮沉淀，渦旋振蕩10s，置冰上30min，其中間隔數(shù)分鐘，渦旋振蕩一次，共3～5次；
1.5 4oC，離心 （13,000 rpm，30min）；
1.6 轉(zhuǎn)移上清，分裝3-4管，每管約20μL。其中一份樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，其余迅速冷凍，-70℃保存。
1.7 濃度測(cè)定后，根據(jù)結(jié)果zui后用Lysis buffer調(diào)濃度至1μg /μL，用于下一步實(shí)驗(yàn)。
2． PCR擴(kuò)增
1.1 吸取2.5μL 10×TRAP buffer，另加入0.5μL dNTPs， 0.5μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入19.5μL ddH2O，于PCR擴(kuò)增儀上23 oC保溫30min；
注：蛋白上樣范圍較廣，可從10ng～10μg，建議根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。
1.2 上述各管中加94℃加熱1分鐘滅活。
1.3 向上述各管中加入2.5μL 10×TRAP buffer，0.5μL dNTPs，0.5μL TS primer，1μL CX primer，0.5μL Taq-DNA polymerase，18μL ddH2O，混勻，于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增：
94 °C，3 min；
94 °C，30s；45°C，35s；72 °C，90s；5個(gè)循環(huán)；
72 °C，延伸60s。
1.4 在上述擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，暫停儀器運(yùn)行，快速向各管中加入內(nèi)標(biāo)模板1μL，內(nèi)標(biāo)引物1μL。繼續(xù)運(yùn)行儀器，進(jìn)行以下的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)：
94 °C，60s；
94 °C，40s；60°C，35s；72 °C，50s；35-36個(gè)循環(huán)；
72 °C，延伸10min。
以下步驟的試劑需用戶自備：
3． 聚丙烯酰胺凝膠電泳
3.1 制備10％非變性聚丙烯酰胺凝膠（20ml）
| 37％Acr－Bis（36：1） | 5.46 ml |
| ddH2O | 12.4 ml |
| 10×TBE | 2 ml |
| 10％APS | 125μL |
| TEMED | 15μL |
3.2 電壓17.5V/cm，電泳Buffer：0.5×TBE，所制凝膠垂直電泳預(yù)跑1-2小時(shí)；
3.3 取9μL PCR產(chǎn)物加上1μL 10×上樣緩沖液，在電壓17.5V/cm，10％非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳50～60min；
4． 銀染
4.1 將凝膠置10％乙酸固定30min，然后用蒸餾水漂洗3次，每次5min；
4.2 將凝膠置于0.2 g/L硫代硫酸鈉浸泡1min，然后用蒸餾水漂洗3次，每次30s；
4.3 將凝膠置于硝酸銀染液浸泡30min，然后用蒸餾水漂洗15s；
4.4 將凝膠置于顯色液中顯色10min左右直到全部條帶顯色為止；
4.5 zui后將凝膠置于10％乙酸浸泡5min終止反應(yīng)。
用戶自備試劑配方：
硝酸銀染液（100mL） 10×上樣緩沖液（10mL）
0.2g 硝酸銀 25mg 溴酚蘭
25μL 37％甲醛 4g 蔗糖
定容至100mL 定容至10mL
10×TBE（pH=8.3） （100mL） 顯色液（100mL）
10.8g Tris 3g 碳酸鈉
5.5g 硼酸 25μL 37％甲醛
4ml 0.5M EDTA 0.4mg 硫代硫酸鈉
定容至100mL 定容至100mL
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