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PEI轉(zhuǎn)染的方法

2015-12-25  閱讀(11290)

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PEI轉(zhuǎn)染的方法

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(*轉(zhuǎn)染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記,如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

PEI轉(zhuǎn)染的方法
材料:質(zhì)粒DNA  指數(shù)生長(zhǎng)的真核細(xì)胞    PEI (聚乙烯亞胺,是線性的)  1×HBS (pH7.4)
配方:  PEI 儲(chǔ)存液(100 μM):稱取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS (pH7.4)
中, 0.2 μm 濾膜過(guò)濾,儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
1×HBS (pH7.4): 將8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超純水,加入20 ml 1 M 的
HEPES,調(diào)pH 值到7.4,定容至1 L,過(guò)濾(0.2 μm 濾膜)后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
方法:
1.細(xì)胞分盤(pán): 通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞,用適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基以4×105 至8×105
細(xì)胞/cm2 的密度平鋪細(xì)胞于60 mm 組織培養(yǎng)皿上(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿,
使細(xì)胞貼壁后所占總面積達(dá)到培養(yǎng)皿面積的70-90%)。根據(jù)細(xì)胞貼壁情況于
含5% CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當(dāng)細(xì)胞貼壁*后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染
前換入2 mL 預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基。
2. 制備PEI-DNA 混合物:以60 mm 組織培養(yǎng)皿用420 μL 反應(yīng)總體積為例。準(zhǔn)
備兩支1.5 mL 離心管,一管將質(zhì)粒DNA(總量2-8 μg 為佳)加入240 μL HBS
中,混勻。另一管中則用HBS 將100 μM 的PEI 儲(chǔ)存液稀釋成10 μM,充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中,充分混勻后
室溫靜置20-30 min。zui后將這420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述單層
細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中,輕輕搖動(dòng)平皿混勻,置于含5%~7% CO2 的37℃ 溫箱
孵育。
注:每次用100 μM 的PEI 儲(chǔ)存液前都需要先將其充分混勻,保證所取的
濃度一致。
3. 培養(yǎng)6-10 h 后更換為37℃預(yù)熱的含有血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),16 h 左右
可以觀測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)。

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