磷酸转乙酰酶（PTA）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5465

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂四：临用前取1支试剂四，加入0.6 mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融（1支试剂四溶解后可做60S，为了延长试剂盒使用时间，此产品多给1支粉剂）。

产品说明：

磷酸转乙酰酶（Phosphotransacetylase，PTA，EC 2.3.1.8）是与乙酸代谢相关的关键酶之一，乙酸在乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的作用下生成乙酰辅*A，以此来连接糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化。PTA催化乙酰辅*A和无机磷反应生成辅*A和乙酰磷酸，该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，其在412nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、分析天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 试剂一于25℃预热10min左右。

3. 操作表：

将上述试剂按顺序加入微量玻璃比色皿/96孔板中，充分吸打混匀，记录412nm波长下15秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入25℃水浴准确反应2分钟（若酶标仪带有控温功能，将温度调至25℃）；迅速取出比色皿并擦干，记录412nm波长下2分15秒时的吸光度A2，并计算ΔA测定=A2测定-A1测定，ΔA对照=A2对照-A1对照，ΔA=ΔA测定-ΔA对照。每个测定管需设置一个对照管。

三、磷酸转乙酰酶（PTA）活性计算

1. 使用微量玻璃比色皿测定：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

PTA活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（Cpr×V样本）÷T=147.059×ΔA÷Cpr

（2） 按样本质量计算

单位的定义：25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

PTA活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（W×V样本÷V提?。?/span>÷T=147.059×ΔA÷W

（3） 按细菌/细胞计算

单位的定义：25℃下每10⁶个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

PTA活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（N×V样本÷V提?。?/span>÷T=147.059×ΔA÷N

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL； V样本：反应体系中加入的样本体积，0.05mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计。

2. 使用96孔板测定：

将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失效。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 样本较多时，可根据样本数量按操作表配制工作液（试剂一、二、三），因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。

4. 如果样本ΔA过低，可适当加大样本量后重新测定；如果样本ΔA大于0.6（微量比色皿）或者0.4（96孔板），建议将样本用提取液适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1056g成熟梨果肉样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A2测定-A1测定=0.1013-0.0620=0.0393，ΔA对照=A2对照-A1对照=0.0571- 0.0558=0.0013，ΔA=ΔA测定-ΔA对照=0.0393-0.0013=0.0380，按样本质量计算酶活得：

PTA活性（U/g 质量）=147.059×ΔA÷W= 147.059×0.0380÷0.1056=52.919 U/g 质量。

2. 取5.76×10⁶个细胞，加入0.8mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用微量玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A2测定-A1测定=0.2411-0.1402=0.1009，ΔA对照=A2对照-A1对照=0.1775-0.1037= 0.0738，ΔA=ΔA测定-ΔA对照=0.1009-0.0738=0.0271，按细胞数量计算酶活得：

PTA活性（U/10⁶ cell）=0.0271÷（13.6×10^-3×1）×0.2÷（5.76×0.05÷0.8）÷2=0.554 U/10⁶ cell。

参考文献：

[1] Michael M, Karin B, Wolfgang S, et al. Isolation and properties of acetate kinase- and phosphotransacetylase- negative mutants of Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus [J]. Microbiology, 1995, 141(11): 2891-2896.

[2] Miyake M, Kataoka K, Shirai M, et al. Control of poly-beta-hydroxybutyrate synthase mediated by acetyl phosphate in cyanobacteria[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(16): 009-5013.

[3] Bock AK, Glasemacher J, Schmidt R, et al. Purification and characterization of two extremely thermostable enzymes, phosphate acetyltransferase and acetate kinase, from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(6): 1861-1867.

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