目录:北京索莱宝科技有限公司>>生化检测试剂盒-微量法>>微量法生化试剂盒>> BC4425-100T/96S吡咯啉-５-羧酸合成酶活性检测试剂盒 微量
| CAS | 详询 | 纯度 | 详询 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 详询 | 分子式 | 详询 |
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 100T/96S |
| 货号 | BC4425 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农林牧渔,综合 |
| 主要用途 | 吡咯啉 -５- 羧酸合成酶(P5CS)活性检测 |
1-吡咯啉-５-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC4425
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体110 mL×1瓶 | |
提取液二 | 液体1.1 mL×1支 | -20℃保存 |
试剂一 | 液体15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×3支 | |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前取1支加入0.833 mL蒸馏水溶解，现配现用。-20℃分装保存；-20℃保存一周；
2、试剂四：临用前加入3 mL蒸馏水溶解，现配现用。-20℃分装保存；-20℃保存一周。
产品说明：
在干旱、盐渍化、重金属、紫外线等不同的胁迫条件下，均会诱导植物体内脯*酸的积累，对植物起到?；ぷ饔谩８叩戎参镏?，脯*的合成有两条途径，分别以谷/酸和鸟*酸为前体。谷/酸途径主要负责胁迫条件下脯*酸的积累，而鸟*酸途径主要在氮充足条件下起作用，与胁迫情况下脯*酸的积累没有关系。
1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯*酸的谷/酸合成途径中的关键酶，P5CS是一个双功能酶，在NADPH和ATP作用下，可催化谷/酸磷酸化及/氨酸 γ-半醛还原，通过测定NADPH在340 nm处吸光度的变化，可计算出P5CS的活性高低。
Glutamate+Glutamate Gamma-Semialdehyde+NADPH(340nm)+ ATP Compound
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：按质量（g）︰提取液体积（mL）1︰5~10比例（建议称取0.1 g样本，加入1.0 mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后加入10 μL提取液二，于4℃，8000 rpm，离心15 min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂三、试剂四置于冰上待测。
3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中操作）
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
蒸馏水 | 20 | - |
样本 | - | 20 |
试剂一 | 120 | 120 |
试剂二 | 20 | 20 |
试剂三 | 20 | 20 |
试剂四 | 20 | 20 |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340 nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅/37℃培养箱放置5min（酶标仪有控温功能的将温度调制37℃），拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。 | ||
注意：空白管只需测定1-2次。
三、P5CS酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADPH为一个酶活单位。
P5CS酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr÷d
2、按样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol NADPH为一个酶活单位。
P5CS酶活（U/g 质量）= ΔA÷ε÷d×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T =324.76×ΔA÷W÷d
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：微量比色皿光径，1 cm/96孔UV板光径，0.6 cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1.01 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5 min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、当A1测定高于1.5或者ΔA大于0.5时，建议将样本稀释后检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2、尽量使用新鲜样本进行检测，操作时请置于冰上操作。
3、ΔA空白管的数值一般不超过0.05。
实验实例：
1、取0.1g三叶草进行样本处理，样本稀释2倍，按照测定步骤操作（微量石英比色皿检测），计算得ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.0302-0.9842=0.046，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7431-0.7248=0.0183，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0277，按照样本质量计算酶活得：
P5CS酶活（U/g 质量）=324.76×ΔA÷W=179.9U/g 质量。
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