目录:北京索莱宝科技有限公司>>生化检测试剂盒-微量法>>微量法生化试剂盒>> BC4345-100T/48S亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒 微量法
| CAS | 详询 | 纯度 | 详询 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 详询 | 分子式 | 详询 |
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 100T/48S |
| 货号 | BC4345 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农林牧渔,综合 |
| 主要用途 | 亚铁氧化酶(HP)活性检测 |
亚铁氧化酶（HP）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC4345
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入6 mL蒸馏水溶解备用，用不完的试剂2-8℃保存4周。
2、标准品：9 µmol/mL的亚铁离子标准液。
产品说明：
亚铁氧化酶（Hsphasetin，HP）是铜蓝蛋白的同系物，催化亚铁离子（Fe2+）氧化为三价铁离子（Fe3+），从而三价铁与转铁蛋白结合，参与细胞铁释放。
以一定浓度的Fe2+ 为底物，在亚铁氧化酶的催化作用下Fe2+ 被氧化为Fe3+，Fe2+ 与菲咯嗪形成有色复合物，在562 nm处有特征吸收峰，先计算出未被氧化的Fe2+ 的含量，进而得出被氧化的Fe2+ 的含量，可通过Fe2+被氧化的速率来反映亚铁氧化酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1 g，加入1 mL蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于10000 rpm，4℃离心10 min，取上清置于冰上待测。
2、血清或血浆：建议用蒸馏水将血清或血浆稀释2~4倍后直接检测。若溶液浑浊则离心取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至562 nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将9µmol/mL的亚铁离子标准液用蒸馏水倍比稀释为360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的标准溶液备用。
3、 标准液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度（nmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（nmol/mL） |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
备注：实验中每个标准管需40µL标准溶液。
4、 操作表：在1.5 mL离心管（分光光度计）或96孔板中依次加入下列试剂：
试剂名称 | 对照管 | 测定管 | 无基质管 | 空白管 | 标准管 |
蒸馏水（µL） | - | - | 8 | 8 | 8 |
样本（µL） | 8 | 8 | - | - | - |
试剂一（µL） | 112 | 112 | 112 | 112 | 112 |
用移液枪充分吹打混匀 | |||||
试剂二（µL） | - | 40 | 40 | - | - |
标准溶液（µL） | - | - | - | - | 40 |
蒸馏水（µL） | 40 | - | - | 40 | - |
混匀，37℃水浴锅或恒温培养箱中准确反应3 min | |||||
试剂三（µL） | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀，于微量玻璃比色皿/96孔板中测定562 nm处吸光值A，分别记为A对照管，A测定管、A无基质管、A空白管和A标准管。计算ΔA测定=（A无基质管-A空白管）-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管，同一批次无基质管、空白管和标准管只需测1-2次。 | |||||
三、亚铁氧化酶活性计算
1、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度（nmol/mL）为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA测定带入方程得到样本浓度（x，nmol/mL）。
2、 亚铁氧化酶活性的计算：
（1）按照样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg蛋白每分钟氧化1 nmol的Fe2+ 定义为1个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V试剂二÷（V样×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
（2）按照样本质量计算
酶活定义：每g样品每分钟氧化1 nmol的Fe2+ 定义为1个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/g鲜重）= x×V试剂二÷（V样×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N
（3）按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每分钟氧化1 nmol的Fe2+ 定义为1个酶活力单位。
亚铁氧化酶酶活（U/mL）= x×V试剂二÷V样÷T×N = 1.667x×N
V试剂二：加入的试剂二体积，0.04 mL；V样：加入的样本体积，0.008 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：3 min；N：稀释倍数。
注意事项：
1. 当A测定低于0.1时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
实验实例：
1、 取0.1g结肠，进行样本处理，按照测定操作步骤，测得计算ΔA测定 =（A无基质管-A空白管）-（A测定管-A对照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，带入标准曲线y = 0.0031x - 0.0007，计算x=11.710，按照样本质量计算酶活得：
亚铁氧化酶酶活（U/g质量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g质量。
2、 取兔血清，按照测定操作步骤，测得计算ΔA测定=（A无基质管-A空白管）-（A测定管-A对照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，带入标准曲线y = 0.0031x - 0.0007，计算x=184.935，按照液体体积计算酶活得：
亚铁氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL
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