蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号: BC4315

规格: 100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入2.5 mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融；

2、 标准品：20 mg果糖，临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配成20 mg/mL果糖溶液备用，2-8℃保存一周。

产品说明：

蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖， 参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。

分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5 –二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、 将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为8、6、5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。

3、 操作表 (在1.5mL离心管中操作) ：

三、SS-I活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。

2、 SS-I活性的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。

SS- I酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T=33.33x÷Cpr。

（2）按样本质量计算

酶活定义：每g样本每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。

SS- I酶活（U/g质量）=x×V提取×10³÷W÷T=33.33x÷W。

V提?。禾崛∫禾寤?，1mL；10³：单位换算系数，1mg=10³µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：30min。

注意事项：

1. 当A或ΔA超过1.5时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

2. 95℃水浴时EP管盖紧，防止水分散失，待冷却至室温后（建议每次实验后冷却时间保持一致），再进行下一步操作，避免液体飞溅烫伤以及影响试验数据。

实验实例：

1. 取0.1g黑麦草加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得A对照管=0.111，A测定管=0.408，标准曲线y =0.1231x-0.0365，A空白管=0.050，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.408-0.111=0.297，x= (0.297+0.0365) ÷0.1231=2.7092，按样本质量计算酶活得：

SS-I酶活（U/g质量）=33.33x÷W=33.33×2.7092÷0.1= 902.976 U/g质量。

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