目录:北京索莱宝科技有限公司>>生化检测试剂盒-微量法>>微量法生化试剂盒>> BC2665-100T/48S多聚半乳糖醛酸酶(PG)检测试剂盒 微量法
| CAS | 详询 | 纯度 | 详询 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 详询 | 分子式 | 详询 |
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 100T/48S |
| 货号 | BC2665 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农林牧渔,综合 |
| 主要用途 | 测定意义：多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一种细胞壁结合蛋白,可以催化 |
多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号: BC2665
规格:100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：若溶液中有晶体析出，37℃水浴溶解；
2、 试剂二：临用前加入10 mL蒸馏水，60℃水浴助溶；
3、 标准品：10mg半乳糖醛酸。临用前加入0.943 mL蒸馏水，配成50 μmol/mL的标准液；
产品说明：
多聚半乳糖醛酸酶（Ploygalacturonase，PG）属果胶酶的一种，广泛存在于植物、细菌及真菌中。其催化多聚半乳糖醛酸分解，在果实软化、花粉授粉、种子发育成熟及器官脱落等方面具有重要作用，并且病原菌在侵染宿主植物时，可分泌多聚半乳糖醛酸酶来降解宿主细胞壁，进而导致病程发展。
PG水解多聚半乳糖醛酸生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与DNS试剂反应生成在540 nm有特征吸收峰的棕红色物质，测定540 nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1 : 5~10的比例（建议称取约0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，16000 g，离心10 min，取上清置于冰上待测。
细菌：先收集细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细菌数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细菌加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细菌（功率200 W，超声3 s，间隔7 s，总时间5 min）；然后4℃，16000 g，离心10 min取上清置于冰上待测。
液体：直接检测或用提取液稀释后检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至540 nm，蒸馏水调零。
2. 将50 μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为6、5、4、3、2、1.5 μmol/mL的标准溶液备用。
3. 操作表：（在1.5mL离心管中）
试剂名称 (μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 25 | 25 | - | - |
蒸馏水 | - | - | 25 | - |
标准溶液 | - | - | - | 25 |
试剂一 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 50 | - | 50 | 50 |
40℃ 水浴准确反应2 h后，沸水浴加热10 min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温。 | - | |||
试剂二 | - | 50 | - | - |
试剂三 | 125 | 125 | 125 | 125 |
沸水浴加热5 min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温。 | ||||
吸取200 μL反应液，测定540 nm处的吸光度，记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管，计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。 | ||||
三、PG酶活计算
1. 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA带入方程得到x（µmol/mL）。
2. PG酶活的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每毫克蛋白每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T = 0.5x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每克样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG酶活（U/g 质量）= x×V提取÷W÷T = 0.5x÷W
（3）按照细菌数量计算
酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每104个细菌每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG酶活（U/104 cell）= x×V提取÷T÷细菌数量（万个）=0.5x÷细菌数量（万个）
（4）按液体体积计算
酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每mL样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位。
PG酶活（U/mL）= x×V样÷V样÷T = 0.5x
V提?。杭尤胩崛∫禾寤?/span>1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：反应体系中样本体积，0.025 mL；T：酶促反应时间，2 h。
注意事项：
1、 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。
2、 当A大于2时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
3、 植物果实组织建议将样本稀释10倍或20倍后再测定。
4、 若样本ΔA值偏小，建议延长酶促反应时间，并在计算公式中除以相应时间。
实验实例：
1、 取0.1g木槿花加入1mL提取液冰浴匀浆后于4℃，16000 g，离心10 min，取上清稀释2倍后按照测定步骤操作，用微量石英玻璃比色皿测得计算ΔA=A测定管-A对照管=1.6843-1.4916=0.1927，带入标准曲线y=0.2426x-0.2979，计算得x=2.022µmol/mL，按样本质量计算：
PG酶活（U/g质量）= 0.5x÷W×2（稀释倍数）=20.22 U/g质量。
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