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线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC2165

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液二：易挥发试剂，用完后盖紧盖儿后及时放回-20℃保存；

2、 试剂三：临用前加入0.375 mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 标准品：10 mg α-酮戊二酸。临用前加入684 μL蒸馏水，配成100 μmol/mL标准液，2-8℃保存8周；

4、 工作液的配制：临用前根据用量将试剂一、试剂二按1:1比例混合，现配现用。

产品说明：

线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式，以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶，和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。

异柠檬酸脱氢酶的主要功能，是在体内三羧酸循环中，催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，将NAD还原成NADH，通过测定α-酮戊二酸的生成量，可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约0.2 g组织或收集1000万细胞，加入1mL提取液一和10μL提取液二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 4℃，1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g离心15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入400μL提取液三和4μL提取液二，超声波破碎（功率300w，超声5秒，间隔9秒，4min），4℃，10000g离心10min，取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。

3、 标准溶液稀释表

实验中每个标准管需40µL标准溶液。

4、 操作表（在0.6 mLEP管/96孔板中进行如下操作）：

三、ICDHm活性计算

1、标准曲线绘制

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。

2、酶活力计算

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm酶活力（U/mg prot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×10³=x÷Cpr×16.67

V上清：加入上清液体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；V反总：反应体系总体积，0.2mL；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

注意事项：

1、 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

3、 测定蛋白浓度时，由于试剂一本身含有蛋白（约1mg/mL），所以测定时需扣除此部分蛋白。

4、 附：使用样本重量计算公式

A、上清（胞浆）中ICDHm活力计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=16.83×x÷W

V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样：加入上清液体积，0.04mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

B、沉淀（线粒体）中ICDHm活力计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性（U/g 质量）=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×10³=6.73×x÷W

V提?。撼恋碇匦奔尤胩崛∫禾寤?/span>0.404mL；V样：加入上清液体积，0.04mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1h=60min；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。

C、样本ICDHm总活力计算：

样本ICDHm总活力即为上清（胞浆）中ICDHm活力与沉淀（线粒体）中ICDHm活力之和。

按样本质量计算：ICDHm（U/g 质量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W

实验实例：

1、 取0.2g小鼠肾脏加入1.5 mL提取液一和15 μL提取液二，用冰浴匀浆器匀浆。4℃，1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g离心15min。上清液即胞浆提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超声波破碎，4℃，10000g离心10min，取上清液，分别按操作步骤检测，用96孔板测得：胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0.25-0.25=0，线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.433-0.279=0.154，带入标准曲线y=0.5533x+0.0319计算x值，按样本质量计算酶活得：

胞浆中ICDHm活性（U/g质量）=16.83×x÷W=0 U/g质量

线粒体中ICDHm活性（U/g质量）=6.73×x÷W=7.43 U/g质量

样本总ICDHm（U/g 质量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W=7.43 U/g质量。

2、 取0.3g黑麦草加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴匀浆器匀浆。4℃，1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃，11000g离心15min。上清液即胞浆提取物，上清液稀释2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超声波破碎，4℃，10000g离心10min，取上清液稀释2倍，分别按操作步骤检测，用96孔板测得：胞浆ΔA测定=A测定管-A对照管=0.377-0.34=0.037，线粒体ΔA测定=A测定管-A对照管=0.711-0.649=0.062，带入标准曲线y=0.5533x+0.0319计算x值，按样本质量计算酶活得：

胞浆中ICDHm活性（U/g质量）=16.83×x÷W×2=1.55 U/g质量

线粒体中ICDHm活性（U/g质量）=6.73×x÷W×2=3.66U/g质量

样本总ICDHm（U/g 质量）=16.83×x÷W×2+9.16×x÷W×2=5.21 U/g质量。

相关发表文献：

[1] Xiao Li,Qi Zhao,Jianni Qi,et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the

PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)

参考文献：

[1] Igamberdiev A U, Gardestr?m P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.

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