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詳解非洲豬瘟PCR儀檢測(cè)方法

閱讀：7214 發(fā)布時(shí)間：2021-11-11

　　采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測(cè)，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)消毒和廢棄物處理。檢測(cè)前樣品應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1l的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成勻漿，經(jīng)10000r/min離心取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5皿離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

　　非洲豬瘟PCR儀病毒DNA提取方式：

　　1、DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。

　　2、待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的份數(shù)總和用n表示，取n個(gè)滅菌1.5l離心管，逐管編號(hào)。

　　3、每管加入200uLDNA提取液1，然后分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各200uL，1份樣品換用1個(gè)吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，13000r/min離心10min。

　　4、盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10uLDNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，2000r/min離心10s。

　　5、100℃干浴或沸水浴10min。

　　6、加入90uL無(wú)DNA酶的滅菌去離子水，13000r/min離心10min，上清即為提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>

　　非洲豬瘟PCR儀操作步驟：

　　1、在反應(yīng)混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測(cè)區(qū)分別進(jìn)行提取。

　　2、每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系需使用20uL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液。充分混勻后分裝，每個(gè)PCR反應(yīng)管20uL。轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。

　　3、反應(yīng)管中分別加入提取的DNA溶液5L，使每管總體積達(dá)到25L，記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)。蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心。

　　4、將加樣后的反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄反應(yīng)管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報(bào)告基團(tuán)，小溝結(jié)合物（MGB）為淬滅基團(tuán)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性95℃/3 min；95℃/15s，52℃/10s，60℃/35s，45個(gè)循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。

　　非洲豬瘟PCR儀檢測(cè)閥值設(shè)定原則：閥值線超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的高點(diǎn)，且相交于陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)，或根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。

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