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美麗線蟲免疫染色的特殊性
閱讀：628 發(fā)布時間：2011-3-24美麗線蟲（caenorhabditis）抗原的免疫定位是一種比較新的方法，其基本原理遵循組織切片染色的原則，但美麗線蟲的角質(zhì)膜透化處理給方法學(xué)帶來更大的困難。通過一系列的強(qiáng)烈固定和透化處理步驟，角質(zhì)膜的問題亦可克服。但由于對這種線蟲免疫組化方面的研究起步較晚，時間相對較短， 目前僅有為數(shù)不多的可靠方法，能使抗體透過角質(zhì)膜。其方法學(xué)尚有待進(jìn)一步改進(jìn)和完善。
1．擊破角質(zhì)膜
由于角質(zhì)膜的保護(hù)作用使該類線蟲的染色有一定困難。在幼蟲期這一問題尤其突出，特別是在I。1期，此期的蟲膜對透化作用的抗性zui強(qiáng)。通過*固定及凍融可使角質(zhì)膜的二硫化物減少，從而使抗體能夠透過角質(zhì)膜。在某些情況下，也可使用膠原酶處理角質(zhì)膜。但這些方法都是比較強(qiáng)烈的，常常破壞抗原結(jié)構(gòu)，尤其是凍融過程中冰晶的形成具有強(qiáng)烈的破壞性。在許多其他系統(tǒng)中，例如，對哺乳動物組織，并不推薦凍融，因?yàn)閮鋈诳墒菇M織和細(xì)胞受到破壞。在這種線蟲中，反復(fù)凍融的次數(shù)應(yīng)盡可能減少。膠原酶的使用同樣有一些困難，每批膠原酶的作用不相同；每只蟲在發(fā)育的不同階段，其敏感性亦不同。因此，在對這種線蟲進(jìn)行免疫染色時，應(yīng)注意調(diào)整實(shí)驗(yàn)的條件以適合形成抗原抗體復(fù)合物的所需量。
2．方法概述
實(shí)驗(yàn)方案概括為在多聚甲醛／Bouin固定液中固定，通過凍融進(jìn)行透化處理；在某些情況下也可通過膠原酶處理，或用還原劑處理以打開角質(zhì)膜，然后加入抗體便可透過角質(zhì)膜。對這種線蟲的免疫染色檢測可以使用熒光染料標(biāo)記的二級試劑。
下面討論的實(shí)驗(yàn)方案分為兩部分。*部分列出兩種固定方法；第二部分為抗體的加入和檢測步驟，這些對所有蟲體的染色程序都適用。在*部分中介紹Bouin液和多聚甲醛固定方法。如無特殊需要，推薦使用Bouin固定法作為起點(diǎn)。