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轉(zhuǎn)錄因子的高保真cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA與其他反轉(zhuǎn)錄酶相比，提高保真度。該套件提供高保真反轉(zhuǎn)錄酶，轉(zhuǎn)錄因子的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和校對優(yōu)化兩步法RT-PCR介導(dǎo)酶的混合，使這個產(chǎn)品的*：

 

• 克隆基因的興趣
• 測序轉(zhuǎn)錄
• 與大，全長刀片的生成cDNA文庫
• 生成的基因表達分析，RNA拼接的分析等。

作為該試劑盒在LightCycler ^®  工具及其他實時PCR儀器進行了測試，產(chǎn)品也定量RT-PCR的應(yīng)用程序需要高保真的理想選擇。
該套件包含所有所需的組件合成cDNA適合直接用在定性RT-PCR與傳統(tǒng)的熱循環(huán)儀或定量RT-PCR實時PCR儀器上。50-反應(yīng)包裝尺寸還包括10個控制反應(yīng)（控制的RNA和控制的引物組合）。

反轉(zhuǎn)錄過程中提高準(zhǔn)確度。

• 受益于優(yōu)化的酶與其他常用的反轉(zhuǎn)錄酶（圖1）相比，共混物與7倍更高的保真度。
• 依靠真正的高保真數(shù)據(jù)，由數(shù)百萬個堿基的測序的基因組測序20系統(tǒng)。

結(jié)合精度，靈敏度高，產(chǎn)量高，全長轉(zhuǎn)錄。

• 生成全長轉(zhuǎn)錄至14 kb的與錨定的寡聚（dT）₁₈引物的試劑盒中包括（圖2）。
• 獲得良好的收益。
• 檢測低拷貝數(shù)模板，反轉(zhuǎn)錄低至10頁模板RNA（圖3）。
• 轉(zhuǎn)錄多種模板，即使是困難的（如，富含GC的RNA與高二級結(jié)構(gòu)），在溫度高達55°C

更快地獲得結(jié)果。

• 降低逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時間只需10分鐘（圖4）。
• 爭取成為*個完成（圖5）。

該套件的核心組件的轉(zhuǎn)錄因子的高保真反轉(zhuǎn)錄酶，融合的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和校對調(diào)解酶。兩種酶之間的協(xié)同作用是反轉(zhuǎn)錄的RNA模板與7倍的更高的保真度相比其他常用的逆轉(zhuǎn)錄酶的摻混物的能力的關(guān)鍵。

的轉(zhuǎn)錄因子的高保真逆轉(zhuǎn)錄酶混合物有效的反轉(zhuǎn)錄模板高達14 KB的。逆轉(zhuǎn)錄由于兩個酶組分的高耐熱性和特別優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)，能夠在溫度高達55℃。這允許逆轉(zhuǎn)錄富含GC的具有高的二次結(jié)構(gòu)的模板，而無需包括添加劑，可能會產(chǎn)生負面影響的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的準(zhǔn)確性。

重組逆轉(zhuǎn)錄酶的表達在大腸桿菌中包含的酶的混合物的 大腸桿菌。酶RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，DNA依賴性DNA聚合酶活性，開卷活性和RNase H活性降解RNA中的RNA：DNA雜交體。后者繞過需要執(zhí)行一個額外耗時的核糖核酸酶H孵育步驟逆轉(zhuǎn)錄后，還原反應(yīng)的時間和成本。

該工具包提供*鏈cDNA合成反應(yīng)所需的所有試劑。吸，三個不同的引物系統(tǒng)都可以使用。兩個cDNA合成引物中所提供的試劑盒：隨機六聚體引物和一個錨定的寡聚（dT）₁₈引物。后者被設(shè)計成結(jié)合在開始的聚（A）尾產(chǎn)生全長cDNAs和防止從內(nèi)部站點的poly（A）尾的吸。長的mRNA的5'末端的人數(shù)往往不多，因此，這對于大多數(shù)應(yīng)用，優(yōu)選預(yù)充方法。使用隨機六聚體引物，使吸統(tǒng)一表示所有RNA序列的RNA的整個長度，并允許不攜帶的poly（A）尾的RNA的逆轉(zhuǎn)錄。耐高溫，保護RNA酶抑制劑（包括在套件中）在較高的反應(yīng)溫度保護RNA的降解。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶通常用于cDNA合成的，表現(xiàn)出更高的核酸分析方法中使用的其它DNA聚合酶的錯誤率比。這種缺乏精度導(dǎo)致基站交流或移碼，這在隨后的PCR反應(yīng)中被進一步傳播到一個顯著的數(shù)量。高保真PCR酶（校正）已經(jīng)面世多年，羅氏應(yīng)用科學(xué)的新的高精度逆轉(zhuǎn)錄酶能合成高收益的全長cDNA。

高突變率是逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的一個標(biāo)志。這源于由病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶，它轉(zhuǎn)換到雙鏈DNA病毒的基因組RNA中的基因組的復(fù)制機制。在此過程中，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生頻繁的復(fù)制錯誤。這種不性的一個*的解釋是RT 3'-5'外切核酸酶活性的缺乏。的反向轉(zhuǎn)錄酶的天然高錯誤率不是適合于許多不同的應(yīng)用。

1. 高保真轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)錄酶（混合重組的逆轉(zhuǎn)錄酶和校對調(diào)解酶）
2. 轉(zhuǎn)錄因子的高保真反應(yīng)緩沖液，5倍濃縮
3. 保護核糖核酸酶抑制劑
4. dNTP混合液，PCR級
5. 錨使用oligo（dT）₁₈引物
6. 隨機六聚體引物
7. DTT
8. 水，PCR-級
9. 對照RNA - 純化的總RNA組分的永生化細胞系K-562 *
10. 控制PBGD引物混合物（正向和反向引物）*

*僅包括包裝大小在50-反應(yīng)。

由圖1的轉(zhuǎn)錄因子的高保真反轉(zhuǎn)錄酶和一種常用的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶的準(zhǔn)確性。錯誤率測序基因組測序20系統(tǒng)。RNA反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子高保真逆轉(zhuǎn)錄酶和常用的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶。的反向轉(zhuǎn)錄酶的純化的cDNA和校對聚合酶擴增后，錯誤率計算減去攜帶相同的序列的質(zhì)粒DNA進行PCR對照的錯誤率。的轉(zhuǎn)錄因子的高保真度ReverseTranscriptase的錯誤率是四個獨立的實驗，其中在至少3.1×10 ⁶堿基進行測序的平均值。對于M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，4.5×10 ⁶堿基進行測序。
精度被表示為-1，錯誤率平均成功被反轉(zhuǎn)錄是由一個單一的轉(zhuǎn)錄錯誤之前的堿基數(shù)。轉(zhuǎn)錄因子的高保真度逆轉(zhuǎn)錄示出更高的精度比標(biāo)準(zhǔn)M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，所得cDNA的合成過程中在較低的錯誤率。

圖2：比較不同的逆轉(zhuǎn)錄總RNA反轉(zhuǎn)錄為不同的片段大小。

總RNA（1微克1微克從HeLa細胞的總RNA為5.4 kb和9.4 kb的片段從人體肌肉總RNA為2.3 kb的片段; 2微克的12.4 kb的片段）的大鼠腦總RNA反轉(zhuǎn)錄具有不同的反轉(zhuǎn)錄酶，根據(jù)制造商的建議。5微升等分每個基因的反應(yīng)與羅氏的展開長距離dNTPack，隨后被放大。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子高保真cDNA合成試劑盒有效地轉(zhuǎn)錄從其他供應(yīng)商的逆轉(zhuǎn)錄酶相比更大的產(chǎn)量和特異性片段的大小與范圍廣泛的。

圖3：比較用于cDNA反應(yīng)的不同的孵育時間，使用的轉(zhuǎn)錄因子高保真cDNA合成試劑盒。

1微克的HeLa細胞的總RNA的逆轉(zhuǎn)錄所示的時間，在50℃。五微升等份的8.5 kb DNA段的引物進行擴增的cDNA反應(yīng)，使用羅氏公司的展開長距離dNTPack的。所有反應(yīng)均進行雙份。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子高的保真度的cDNA合成試劑盒有效抄寫RNA具有較高的速度和準(zhǔn)確性的。

圖4：用于cDNA反應(yīng)的不同的溫育時間，使用比較。

所示的時間，在50℃1μg的HeLa細胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄。取5微升的8.5 kb DNA段的引物進行擴增的cDNA反應(yīng)，使用羅氏應(yīng)用Sciende的展開長距離dNTPack的。所有反應(yīng)均進行雙份。

圖5：*完成轉(zhuǎn)錄因子的高保真cDNA合成試劑盒。 

轉(zhuǎn)錄因子的高保真cDNA合成試劑盒相比，我的cDNA合成試劑盒，包括核糖核酸酶H ^- M-MULV 供應(yīng)商降低總的反應(yīng)時間約1小時。

圖6： 合成后至1小時，在室溫下貯存cDNA，沒有松動性能。圖7：在整個溫度范圍內(nèi)的困難模板的擴增。



在不同溫度下的GC含量在74％的富含GC的RNA與逆轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄因子的高保真cDNA合成試劑盒。5微升等分的每一個基因的反應(yīng)，隨后與羅氏應(yīng)用科學(xué)部的展開長模板PCR系統(tǒng)擴增。