ELISA法檢測(cè)肺炎支原體

    肺炎支原體可引起支原體肺炎，曾被稱為“非典型肺炎”。支原體肺炎通常起病緩慢，病情嚴(yán)重，體征輕微，肺炎常為間質(zhì)性。此外，肺炎支原體與人腦組織有共同抗原，故亦可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。臨床上一般通過檢查肺炎支原體抗體IgG、IgM診斷支原體肺炎。

    （一）肺炎支原體抗體IgG檢測(cè)

    [檢測(cè)方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  在微孔反應(yīng)板上包被純化的肺炎支原體抗原，加入待測(cè)標(biāo)本孵育后，使之發(fā)生反應(yīng)，然后去除未結(jié)合的抗體，加人結(jié)合有過氧化物酶的抗人IgG抗體，使之與已結(jié)合的抗體反應(yīng)，結(jié)合的過氧化物酶與發(fā)色底物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生顏色。zui后，終止底物反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀出吸光度值。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗(yàn)，分離血清后將其保存于一20℃。檢測(cè)時(shí)，使樣本恢復(fù)至室溫。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔板

    2．陽性對(duì)照

    3．弱陽性對(duì)照

    4．陰性對(duì)照   

    5．標(biāo)本稀釋液

    6．濃縮酶聯(lián)物

    7．底物A、B

    8．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀

    [檢測(cè)步驟]

    1．配制洗滌液  1瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內(nèi)可置室溫環(huán)境中，長(zhǎng)期可存于2～8℃環(huán)境中。

    2．配制酶聯(lián)物  按1：101倍稀釋，取10gl濃縮酶聯(lián)物，加酶聯(lián)物稀釋液1 000ul（根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定稀釋量），未用完的丟棄。

    3．待試劑盒平衡至室溫后，待測(cè)標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液按1：201稀釋，即取1P1血清與200gl標(biāo)本稀釋液混合。

    4．各加100gl陽性、弱陽性、陰性對(duì)照及已稀釋待測(cè)標(biāo)本上清液于相應(yīng)孔中，空白對(duì)照孔加100~I標(biāo)本稀釋液，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中孵育30min。

    5．甩盡板中液體，每孔用200—300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干。

    6．每孔加酶聯(lián)物100ul，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中30rain。

7．甩盡板中液體，洗5次，每次拍干。

8．加底物A、B各1滴或各50gl，混勻，37℃環(huán)境中15min。

    9．取出，加終止液1滴，用酶標(biāo)儀450nm測(cè)其OD值，若肉眼觀察則不加終止液。

    [結(jié)果判斷]

    1．陰性對(duì)照平均OD值須小于0．20。

    2．弱陽性對(duì)照平均OD值須在0．20～0.65

    3．弱陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的平均OD值之比須≥2。符合以上3個(gè)條件時(shí)本試驗(yàn)結(jié)果可信，否則重復(fù)試驗(yàn)。

    4．若待測(cè)標(biāo)本孔顯色比弱陽性對(duì)照孔深，則判為陽性，反之為陰性。但若在弱陽性對(duì)照值上下10％范圍內(nèi)再測(cè)1次，如確實(shí)高于弱陽性對(duì)照時(shí)可判為陽性。

    [注意事項(xiàng)]  本試驗(yàn)結(jié)果須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史作出診斷后，方可采取適當(dāng)臨床處理。

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